霍亂弧菌單重熒光PCR檢測試劑盒的品牌是百奧萊博，是優(yōu)質的細菌PCR檢測試劑盒產品，本制品用于科研目的，我公司的霍亂弧菌單重熒光PCR檢測試劑盒品質上佳，經過多年的開發(fā)生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括霍亂弧菌(O1)單重熒光PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：霍亂弧菌(O1)單重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA074
產品規(guī)格：48次/盒



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名稱：阪崎腸桿菌單重熒光PCR檢測試劑盒
貨號：SYA001
規(guī)格：48次/盒
本試劑盒適合于增菌培養(yǎng)物、疑似病料及食品中阪崎腸桿菌(ESKZ)的檢測。阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是乳制品中近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種致病菌。它是存在自然環(huán)境中的一種“條件致病菌”，已被衛(wèi)生組織和許多確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，可導致任何年齡層人群的疾病，尤其是對早產兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅zuì大，嚴重者可導致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結腸炎。本方法為熒光PCR檢測方法，反應在同一管內連續(xù)進行，操作簡單，并有效防止了污染，能對樣品中或預培養(yǎng)液中的阪崎腸桿菌進行快速檢測，具有特異性高、敏感性強和操作簡便的特點。

試劑盒組成：

組分	規(guī)格
熒光PCR反應液(ESKZ-qPCR MIX)	672μL
DNA抽提液(DNA Extraction )	2mL
酶混合物(DNA Polymerase MIX)	48μL
陰性對照(NTC)	50μL
陽性對照(ESKZ -PTC)	50μL

儲存條件：-18℃以下，有效期6個月。

使用方法：

一、樣品采集：
?食品樣品：樣品的采集與預培養(yǎng)按照樣品的采集與預培養(yǎng)按照《食品衛(wèi)生微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗(GB/T 4789.40-2008)要求進行。
?血液樣品：用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL，注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。
?糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
?病灶部位樣品：取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
 注：上述樣品建議經過增菌后，收集培養(yǎng)物用于檢測。

二、DNA提取：
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購北京百奧萊博科技有限公司生產的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
?液體培養(yǎng)物：取液體培養(yǎng)物100μL加到1.5mL無菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
?固體培養(yǎng)物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
?糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
?其他液體標本：取標本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

三、檢測步驟：
1．試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(ESKZ -qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：

試劑	每個反應加入的量	N個反應加入的量
熒光PCR反應液	14 μL	N×14μL
酶混合物	1 μL	N×1 μL
總量	15 μL	N×15μL

計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(ESKZ -PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
2．qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件：

	1循環(huán)	50℃ for 2 min
預變性	1循環(huán)	95℃ for 10min
PCR擴增	40循環(huán)	95℃ for 15s 60℃ for 60s

在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM

四、結果分析：
1．結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
2．試驗成立判定
?陰性對照(NTC)：不應產生任何的擴增曲線。
?陽性對照(ESKZ -PTC)：均產生擴增曲線，且Ct值≤35。
?以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
3．結果判定
?在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明阪崎腸桿菌核酸陽性。
?Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明阪崎腸桿菌核酸陰性。
?如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
?對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行阪崎腸桿菌real time PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，判為樣本陽性，表明阪崎腸桿菌核酸陽性；否則判為樣本陰性。

五、注意事項：
?初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
?所有使用的離心管應高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
?PCR操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
?樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
?試劑盒里所有物品應視為污染物對待，按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

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