本試劑盒提供全套試劑，適用于從各種植物細胞和各種實體植物組織，如葉片、根、種子等植物組織中提取核蛋白。提取過程簡單方便。制備的核蛋白不僅純度高，保持天然活性，而且絕少交叉污染。本試劑盒含有的獨特配方能夠有效溶解植物核組份。含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保...

產(chǎn)品特點：

1、使用方便。

2、含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

3、紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

4、蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含5種獨立的蛋白酶抑制劑Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機 ● 振蕩器 ● 渦旋混勻器 ● Dounce勻漿器/勻漿機

● PBS ● 蛋白定量試劑盒

使用注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 可以根據(jù)自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

使用方法：

1、提取液制備：

每200μL提取液C中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、取洗凈擦干并去除葉梗和粗脈的200-500mg植物組織樣本用手術剪刀盡可能剪碎，加入1-2mL PBS后用勻漿機充分勻漿或者加適量PBS后用Dounce勻漿器充分勻漿。

3、將勻漿液用100μm細胞篩過濾；

【注】：

● 沒有細胞篩的話，在4℃，稍微靜置，讓粗纖維，成團組織塊等沉降，或者以低于100×g力條件下離心1分鐘，收集細胞上清，棄組織沉淀。

● 有些含黏液較多的樣品可能難以吸取，可以將1mL 吸頭尖稍微剪掉一點使用。

4、將濾液在2000×g條件下離心5-10分鐘，收集沉淀。

5、在沉淀中加入500μL提取液A，充分混勻。

【注】：

● 培養(yǎng)細胞1000×g條件下離心5分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細胞后用PBS洗滌2次，然后直接加入提取液A 重懸。

● 大約每300μL細胞壓積中加入1mL 提取液A。

● 一般加入樣本體積的2-3倍體積的提取液A，充分淹沒樣本即可。

6、將細胞懸液置振蕩器上37℃或室溫振蕩12-72小時。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，中間每隔幾小時用移液器吹打混勻即可。

● 根據(jù)下游蛋白的應用選擇合適的溫度，最佳溫度為55℃。

● 不同類型的植物樣本需要處理的時間差異較大。擬南芥較易處理，鮮嫩葉片較易處理，年齡小的樣本處理時間短。擬南芥嫩葉最短4 小時即可。

● 部分細胞壁較厚的植物類型可能需要處理更長時間。可以延長至72小時以上處理以提高核蛋白得率。

7、在2000×g條件下離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。

8、在沉淀中加入500μL-1mL提取液B，用Dounce勻漿器充分勻漿，在勻漿液中補充提取液B至1mL，充分混勻。

9、置振蕩器振蕩5-10分鐘。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，置4℃靜置，稍微延長處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

10、在2000×g條件下離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。

11、在沉淀中加入100-200μL冷的提取液C，高速渦旋振蕩5秒。

12、置4℃振蕩20-40分鐘。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，置4℃靜置，稍微延長處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

13、在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。

14、將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。

15、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?/span>

【注】：

● 建議用BCA法進行蛋白定量。相關產(chǎn)品：HR0329。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

植物核蛋白豐度比較低，在條件允許的情況下，盡可能增加樣本量。

處理部分樣本時可能沒有裂解完全，導致蛋白濃度低。只要適當增加試劑A的勻漿次數(shù)，并適當延長試劑A和B的處理時間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經(jīng)進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取時出現(xiàn)膠狀沉淀？

蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時會出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。不檢測和基因組DNA結合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續(xù)實驗即可；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，不必進行超聲處理。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。

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