變性蛋白裂解液采用優(yōu)質(zhì)原料配制，對動物細胞胞膜、胞漿、胞核成分均有較強裂解作用，是經(jīng)典常用的細胞組織快速裂解液。變性蛋白裂解液含有SDS，裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP 等下游實驗，不可用于co-IP。變性蛋白裂解液中已含常用磷酸酶抑制劑。...

細胞裂解：

1、裂解液制備：每1mL冷的裂解液中加入4μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

2、取5-10×10⁶個細胞，在4℃，1000×g條件離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細胞。

3、用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4、每5×10⁶個細胞中加入500μL冷的裂解液（每10⁶個細胞，大約10mg或10μL壓積，加100μL裂解液。大約相當(dāng)于6孔板的每孔加入100μL～150μL，或一個75cm²培養(yǎng)瓶加1mL。裂解液和細胞應(yīng)充分接觸。如果裂解液不足量，細胞裂解效率將會降低），混勻后，在4℃條件下振蕩15-20分鐘。

【注】：

● 使用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

5、在4℃，12000×g條件下離心15分鐘。

6、將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，用于下游實驗。

組織裂解：

1、裂解液制備：每1mL冷的裂解液加入4μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

2、取100mg組織樣本剪碎，加入1mL裂解液，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。

3、將組織勻漿吸入另一預(yù)冷的干凈離心管中，在4℃條件下振蕩15-20分鐘。

4、在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。

5、將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，用于下游實驗。

6、上述蛋白提取物可分裝后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長試劑A的處理時間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取時出現(xiàn)膠狀沉淀？

蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時會出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續(xù)實驗即可；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，不必進行超聲處理。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒含有離子型去垢劑組份，破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白不再保持其天然構(gòu)象和活性。

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