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樊克生物:大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗

發(fā)布時間:2018-08-13瀏覽次數(shù):1145返回列表

細胞經(jīng)過一些特殊方法(電擊法、CaCl2法)等處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的細胞,即感受態(tài)細胞(Compenent cells)。


實驗方法原理:
帶有外源DNA 的重組質(zhì)粒,在體外構(gòu)建后,導入宿主細胞,隨著細胞的大量復制、繁殖,才能夠有機會獲得純的重組質(zhì)粒DNA,該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化學試劑)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生變化,能容許外源DNA 的載體分子通過。


實驗步驟:    
1、從37℃培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm),轉(zhuǎn)到一個含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h。一般經(jīng)驗,1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL。
2、將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培養(yǎng)物冷卻至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特頭(或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭)以4 100 r/min離心10 min,以回收細胞。
4、倒出培養(yǎng)液,將管倒置1 min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5、每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀。
6、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭(或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭)以41 00 r/min離心10 min,以回收細胞。
7、倒出培養(yǎng)液,將管倒置1  min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8、每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml用冰預冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細胞沉淀。
9、此時,可以用新鮮制備的感受態(tài)細胞直接做轉(zhuǎn)化實驗,也可以將細胞凍存于- 70℃。
 

 
注意事項:
1. 為達到轉(zhuǎn)化,活細胞數(shù)務必少于108個細胞/mL,對于大多散大腦桿菌來說,這相當于OD值為0.4左右。為保證細菌培養(yǎng)物的生長密度不致過高,可每隔15-20 min測定OD600值來監(jiān)測,用監(jiān)測的時間及OD值列一個圖表,以便預測培養(yǎng)物的OD600值到0.4的時間,當OD600值達到0.35時,收獲細菌培養(yǎng)物。
2. 在菌株與菌株之間,OD值與每毫升中活細胞散間的關系變化很大,因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的OD600值,并將各稀釋維度的培養(yǎng)物鋪于無抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細胞散,從而使分光光度計讀數(shù)得到標準化。
3.對大多數(shù)大腸桿菌(MC106除外),采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的結(jié)果。Dagert和Ehrlieh的實驗(1979)曾表明,細胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h,在貯存的初12-24 h內(nèi),轉(zhuǎn)化率增加4-6倍,然后降低到初始水平。
4.克隆的新鮮程度,一定要選新鮮平板的單克隆,即剛涂布生長過夜的平板。
5.菌體的OD600值,JM109或BL21,OD值為0.35,DH5α 為0.4,要盡量保證OD值不要過高,更不能超過0.6。
6.低溫處理的時間,做完后冰上保存12-24 h后分裝,并保存于-80℃。
7.試劑和用品,所有的用品(離心管、藥瓶等)用新的,如果使用舊的,要確保干凈,CaCl2溶液。



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