蛋白質(zhì)提取與制備蛋白質(zhì)種類(lèi)很多，性質(zhì)上的差異很大，既或是同類(lèi)蛋白質(zhì)，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類(lèi)蛋白質(zhì)的分離。本文分別介紹了從新鮮樣品中提取總蛋白和從Trizol裂解液中分離總蛋白的方法和步驟。希望與各位老師和同學(xué)交流。

  膜蛋白具有多種功能，在細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸?shù)扔兄兄匾慕巧?，因此也是佳的藥物靶點(diǎn)。抽提膜蛋白主要是進(jìn)行蛋白組分析：常用的實(shí)驗(yàn)是非變性膠電泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot等。本文敘述了總蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法。

  一、從新鮮樣品中提取總蛋白(簡(jiǎn)易法)

  1、自配裂解液(pH 8.5-9.0)：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，調(diào)pH值至8.5-9.0備用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體。

  2、將40ml 菌液在12000g，4℃下離心15分鐘收集菌體，沉淀用PBS懸浮洗滌2遍，沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。

  3、超聲粉碎，采用300w，10s超聲/10s間隔，超聲20min，反復(fù)凍融超聲3次至菌液變清或者變色。

  4、1000g離心去掉大碎片，上清可直接變性后PAGE電泳檢測(cè)，或者用1% SDS溶液透析后凍存。

  缺點(diǎn)：Western Blotting結(jié)果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

  二、從Trizol裂解液中分離總蛋白

  1、Trizol溶解的樣品研磨破碎后，加氯f(wàn)ang分層，2-8℃下10000g離心15min，上層水相用于RNA提取，體積約為總體積的60%。

  2、用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無(wú)水乙醇混勻，室溫放置3min，2-8℃不超過(guò)2000g離心5min。

  3、將上清移至新的EP管中，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇，室溫放置10min，2-8℃下12000g離心10min，棄上清。

  4、用含有0.3M 鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1ml Trizol加入2ml洗液，室溫放置20min， 2-8℃下7500g離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌2次。Z后加入2ml無(wú)水乙醇，渦旋后室溫放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清。

  5、冷凍干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反復(fù)吹打，50℃溫浴使其完全溶解，2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。

  6、替代方案：將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g離心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白實(shí)驗(yàn)。