1.載體構(gòu)建

載體構(gòu)建(vectorconstruction)：載體構(gòu)建是分子生物學(xué)研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點(diǎn)（MCS）的改造和已有載體啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、篩選標(biāo)記等功能元件的改造。是為把DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種能進(jìn)入細(xì)胞、在裝載了外來(lái)的DNA片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體。理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。載體構(gòu)建即是構(gòu)建含外源DNA的質(zhì)粒。

特點(diǎn)：當(dāng)給質(zhì)粒插入一段外源DNA片段后，它依然能夠進(jìn)行自我復(fù)制。

2.多克隆位點(diǎn)

多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site, MCS），指的是包含數(shù)個(gè)（zui多20個(gè)）限制性酶切位點(diǎn)（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點(diǎn)接頭（polylinker），是基因工程中常用到的載體質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)配置序列。MCS上含有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，是外源DNA的插入部位，每個(gè)限制性酶切位點(diǎn)通常是唯1的，即它們?cè)谝粋€(gè)特定的載體質(zhì)粒中只出現(xiàn)一次。不同酶的酶切位點(diǎn)可有重疊。單一酶切位點(diǎn)就是只有一種特定的酶能夠識(shí)別并進(jìn)行酶切的位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)一般是位于質(zhì)粒上的一段序列，這段序列含有很多個(gè)酶切位點(diǎn)，但這些酶切位點(diǎn)每一個(gè)都被一種酶識(shí)別并酶切。

3.質(zhì)粒構(gòu)建

（1）質(zhì)粒構(gòu)建原理

質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中zui常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對(duì)目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。

（2）質(zhì)粒構(gòu)建方式

質(zhì)粒構(gòu)建方式多樣，常規(guī)的T4連接酶，下面就介紹下T4連接酶構(gòu)建質(zhì)粒方法，T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接，但一般推薦適用黏性末端。

（3）質(zhì)粒載體的制備

質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推薦使用雙酶切。其實(shí)目的就只有一個(gè)，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。

4.一般目的基因用于克隆表達(dá)的情況下，酶切位點(diǎn)的選擇要考慮到：

（1）選擇質(zhì)粒上兩個(gè)酶切位點(diǎn)的距離不應(yīng)小于太?。?gt;10bp），否則影響限制性內(nèi)切酶對(duì)切點(diǎn)的識(shí)別，不利于空載體的雙酶切。

（2）一般目的基因用于克隆表達(dá)的情況下，酶切位點(diǎn)的選擇要考慮到：

目的基因片段內(nèi)部不含有所選的酶切位點(diǎn)（不然鑒定陽(yáng)性重組子雙酶切時(shí)會(huì)將目的基因切斷）。

（3）實(shí)驗(yàn)后繼應(yīng)用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點(diǎn)。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克?。?。（不然換載體表達(dá)時(shí)，還要重新設(shè)計(jì)引物，以引進(jìn)新的酶切位點(diǎn)）。

（4）盡可能選比較常用的酶切位點(diǎn)（常用切點(diǎn)酶的價(jià)格比較）。

（5）兩個(gè)酶切點(diǎn)至少隔上3個(gè)堿基。

（6）兩個(gè)酶切點(diǎn)zui好不要是同尾酶（切下來(lái)的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切。

（7）zui好使用酶切效率高的酶。

（8）zui好使用雙酶切有共同buffer的酶。

注：質(zhì)粒構(gòu)建完成后可利用PCR原理進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)