實驗方法原理：

二倍體細胞來源體內(nèi)二倍體細胞，也即正常細胞的初代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)細胞成功后能始終保持二倍體細胞性狀，便成為二倍體細胞培養(yǎng)。

二倍體細胞雖不難培養(yǎng)，但欲求長期呈旺盛地增殖生長、并保持二倍體細胞性狀，亦非易事。為此必須采取一些有效的措施，一是低溫凍存，二是妥善的培養(yǎng)方法。

用反復傳代的方法以求獲得大量細胞和維持細胞長期生存的辦法是不妥的。因在反復傳代中，難免由于培養(yǎng)條件的變化和其它不利影響，使細胞生物學性狀發(fā)生變化。隨時間延長不僅能導致細胞停止生長，并可失掉二倍體性狀或發(fā)生轉(zhuǎn)化。

實驗材料：細胞

試劑、試劑盒：培養(yǎng)液 BSS 胰蛋白酶 消化液

儀器、耗材：培養(yǎng)瓶

實驗步驟：

二倍體細胞培養(yǎng)方法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序為

1.  吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中；

2.  用BSS沖洗1 次；

3.  用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以僅覆蓋住細胞層即可；作用1~5 分鐘；

4.  待細胞附著松動、細胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化；為防止細胞丟失可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中加入培養(yǎng)液（新舊培養(yǎng)液按2：1）新舊混合；

5.  輕輕反復吹打制成單個細胞懸液（消化不足或吹打不充分，易形成細胞團，不利于生長，應(yīng)注意避免）；

6.  按一分為二比例接種培養(yǎng)。

其他：

1.  采取以下措施可能利于二倍體細胞培養(yǎng)

（1）嚴格控制pH值，zui好在5 %CO2溫箱中培養(yǎng)；

（2）換液時間不要間隔太長，且不要全部geng新，盡量保留一部分舊培養(yǎng)液，以棄掉1/2或2/3為妥；

（3）傳代期不能過長，不能讓細胞長得過于密集，一旦細胞接近或剛剛連接成片，即進行傳代；

（4）要選用高質(zhì)量的培養(yǎng)基和血清，并盡量維持不變，每次傳代都按一分為二的原則（細胞數(shù)量、營養(yǎng)液量、培養(yǎng)瓶的空間和面積都不得一樣）進行培養(yǎng)；

（5）傳代后如細胞不用于實驗，立即低溫凍存。

2.  來源于胚胎的二倍體成纖維細胞平均分裂 50 次左右即進入衰退期。

不同種類和來源的二倍體細胞生存期都不一樣，但生存期皆有限。

雖然二倍體細胞具有限的生存期，卻完全能滿足反復使用的要求。

以成纖維細胞為例，即便從初代接種1 個細胞算起，按產(chǎn)生的細胞數(shù)=n×2n（n=接種細胞數(shù)）計算，它所提供的細胞也近天文數(shù)字。而在實際應(yīng)用上，初代接種的細胞都幾十萬以上，因此一個二倍體細胞系zui終提供的細胞數(shù)量近于無限的