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凝膠層析(凝膠過濾法)基本原理
發(fā)布時間:2021-04-22瀏覽次數(shù):1322返回列表
凝膠層析也稱凝膠過濾法,是20 世紀60 年代發(fā)展起來的一種簡便有 效的 生物 化學分離分析方法。這種方法的基本原理是用一般的柱層析方法使 相對分子質量不同的溶質通過具有分子篩性質的固定相(凝膠),從而使物 質分離。
用作凝膠的材料有多種,如交聯(lián)葡聚糖、 瓊脂糖、聚丙烯-酰胺凝膠、聚 苯乙-烯和多孔玻璃珠等?,F(xiàn)以利用交聯(lián)葡聚糖分離物質和測定相對分子質量 為例說明凝膠層析法的基本原理和應用。
交聯(lián)葡聚糖(商品名Sephadex)是由細菌葡聚糖(以右旋葡萄糖為殘基 的多糖)用交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙-烷交聯(lián)形式的有三維空間的網(wǎng)狀結構物??刂破?聚糖和交聯(lián)劑的配比及反應條件就可決定其交聯(lián)度的大?。ń宦?lián)度大,“網(wǎng) 眼”就?。瑥亩玫礁鞣N規(guī)格的交聯(lián)葡聚糖,即不同型號的凝膠?!癎”表 示交聯(lián)度,G 越小,交聯(lián)度越大,吸水量也就越小。
把經(jīng)過充分溶脹凝膠裝入層析柱中,在加入樣品以后,由于交聯(lián)葡聚糖 的三維空間網(wǎng)狀結構,小分子能夠進入凝膠,較大的分子則被排阻在交聯(lián)網(wǎng) 狀物之外,因此各組分在層析床中移動的速度因分子的大小而不同。相對分 子質量(Mr)大的物質只是沿著凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動,其流程短, 移動速度快,先流出層析床。相對分子質量小的物質可以透入凝膠顆粒,流 程長,移動速度慢,比相對分子質量大的物質遲流出層析柱。經(jīng)過分部收集 流出液,相對分子質量(Mr)不同的物質便互相分離。SpladexG-10 到G -50 通常用于分離肽或脫鹽。G-10 到G-50 通常用于分離肽或脫鹽。G-75 到 G-200 可用于分離相對分子質量大于10000 的蛋白質。
交聯(lián)葡聚糖分子含有大量的羥基,極性很強,易吸水,所以使用前必須 用水充分溶脹。1g 干重凝膠充分溶脹時所需的水量(mL)稱為凝膠的得水 值(Wr)。因為得水值不易測定,故常用溶脹度即床體積來表示凝膠的得水 性,其定義是每克干重凝膠顆粒在水中充分溶脹后所具有的凝膠總體積。 2、凝膠柱的總體積(總床體積)Vt 是干膠體積Vg,在凝膠顆粒內部的 水的體積Vi 及凝膠顆粒外部的水的體積Vo 之和。
Vt 也可從柱的直徑及高度計算。
Vo 也稱外水體積。常常用洗脫一個已知完全被排阻的物質(如藍葡聚糖 2000)的方法來測定,此時其洗脫體積就等于Vo。
Vi 稱為內部體積或內水體積,可以從凝膠干重(mg)和得水值Wr 計算: Vi = mg. Wr
Vi 也可以從洗脫一個小于凝膠工作范圍下限的小分子化合物,如鉻-酸鉀 來測定,其洗脫體積等于Vi+Vo。
某一物質的洗脫體積Ve 為:Ve=Vo + KdVi
Kd 為溶質在流動相和固定相之間的分配比例(分配系數(shù)),每一溶質都 有特定的Kd 值,它與層析柱的幾何形狀無關。
如果分子完全被排阻,則Kd=0,Ve=Vo。如果分子可以完全進入凝膠,那 么Kd=1,Ve=Vo+Vi。在通常的工作范圍內Kd 是一個常數(shù)(0〈Kd〈1),有時 Kd 可能大于,則說明發(fā)生了凝膠對溶質的吸附。
溶質的洗脫特征的有關參數(shù)(Ve/Vo,Ve/Vt,Kd,Kav)都與溶質相對分 子質量(Mr)對數(shù)成線性關系,先洗脫幾個已知相對分子質量(Mr)的球 蛋白,用Ve/Vo 對logMr 對作圖,然后在同樣條件下洗脫未知樣品,從其 Ve/Vo 值,在圖上即可找出相對應的logMr,從而進一步算出其相對分子質 量(Mr)。
不同規(guī)格的凝膠都有一定的工作范圍。一般說,在工作范圍之內所得的 曲線是線性的,超出工作范圍曲線就不成線性