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真核細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題分析

發(fā)布時(shí)間:2021-07-22瀏覽次數(shù):1125返回列表

本文主要介紹了真核細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可能遇到的問(wèn)題,包括可能的原因及對(duì)應(yīng)的解決方案。

1. 細(xì)胞培養(yǎng)不貼壁
可能原因
胰蛋白酶消化過(guò)度
支原體污染
培養(yǎng)液中無(wú)貼壁因子

解決方法
① 縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度
② 分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體
③ 清潔支架和培養(yǎng)箱
2. 培養(yǎng)液PH變化過(guò)快

可能原因
CO2張力不對(duì)
培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊
NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足
培養(yǎng)液中鹽濃度不正確/li>
細(xì)菌、酵母或真菌污染

解決方法
① 按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度,2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5%到10%
② 改用不依賴CO2培養(yǎng)液。松開(kāi)瓶蓋1/4圈
③ 加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度
④ 在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle’s鹽配制的培養(yǎng)液,在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hank’s鹽配制的培養(yǎng)液
⑤ 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌

3. 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢
可能原因
換了不同培養(yǎng)液或血清
試劑保存不當(dāng)
培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染
培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞

解決方法
① 比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分
② 比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
③ 增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度
④ 換入新鮮配制培養(yǎng)液,讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液
⑤ 補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子
⑥ 用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄
⑦ 用抗生素除菌

4. 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)死亡
可能原因
培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2
培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大
細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷
培養(yǎng)液滲透壓不正確
培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積

解決方法
① 檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2
② 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度
③ 取新的保存細(xì)胞種
④ 檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓
注意:大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260–350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

5. 黑膠蟲污染
黑膠蟲污染常在培養(yǎng)條件改變、細(xì)胞接種密度降低、細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)顯現(xiàn),尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)可造成大量細(xì)胞死亡。
感染黑膠蟲細(xì)胞的表現(xiàn)
細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)的旺盛,小黑點(diǎn)會(huì)越來(lái)越少,反之則多
可以穿透濾膜,也可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)箱空氣進(jìn)行污染
換掖沖洗后也無(wú)多大作用
低倍鏡下觀察為黑色點(diǎn)狀,高倍鏡(400X)下作不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)

解決方法
① 體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)換好一點(diǎn)的血清
② 如果是貼壁細(xì)胞的話,可用無(wú)菌的PBS洗幾次,可一定程度上緩解。若是懸浮的話,可以向其中少加一點(diǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞(從小鼠腹腔內(nèi)取的巨噬細(xì)胞),加滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)有黑膠蟲的剛復(fù)蘇的細(xì)胞很有一定作用
③ 在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打,沖洗干凈后再加入細(xì)胞培養(yǎng)液,堅(jiān)持天天洗,細(xì)胞傳代時(shí)加生理鹽水再離心一次,稍微加大接種密度,一段時(shí)間后,黑膠蟲數(shù)目會(huì)顯著減少
④ 環(huán)丙沙星+哌拉西林,各10ug/ml,選擇片劑,1.5一盒/6片,每片含環(huán)丙沙星0.25g,磨成粉,PBS溶解,稀釋到適當(dāng)濃度,過(guò)濾,4度保存。哌拉西林用的注射粉劑,2.5g/瓶,溶解到相應(yīng)濃度,加入PBS和培養(yǎng)基中,可以觀察到黑膠蟲數(shù)量明顯減少。

6. 支原體污染
支原體污染表現(xiàn)
細(xì)胞形態(tài)改變,一般是有梭形變成圓形,不再貼壁生長(zhǎng),漂浮光鏡下,可以看到細(xì)胞膜上吸附很多圓點(diǎn),40*16倍下約有0.1mm,分布多集中于細(xì)胞核周圍和細(xì)胞邊緣,中間部位較少消化時(shí)可以看到圓點(diǎn)從細(xì)胞膜上游離出來(lái),很多,還會(huì)動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)液變堿,有大量小黑點(diǎn)游離

解決方法
① 添加抗支原體劑量的pbs或者其他平衡鹽液進(jìn)行潤(rùn)洗,然后消化。
② 常規(guī)離心,用添加抗支原體(沙星類較為有效)的完全培養(yǎng)液重懸,植入新的培養(yǎng)瓶
③ 培養(yǎng)并且密切觀察(抗支原體推薦使用的濃度及時(shí)間如下)
恩諾沙星 25μ/ml,治療時(shí)間一周
環(huán)丙沙星10μ/ml,治療時(shí)間兩周
司氟沙星10μ/ml,治療時(shí)間一周
治療時(shí)間滿后撤藥換用普通雙抗培養(yǎng)基或者無(wú)抗培養(yǎng)基,另外特別說(shuō)明因?yàn)橐陨纤幬锞笹+-,所以添加的時(shí)候不需要再添加常規(guī)雙抗

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