（一）慢病毒安全操作規(guī)范
古朵生物慢病毒載體是第三代慢病毒載體，其 3" LTR 的增強(qiáng)子功能發(fā)生缺失，形成了自滅活（sefl-inactivating，SIN）的 3’ LTR, 5’LTR 中的 U3 區(qū)替換成CMV，是安全的慢病毒載體。但操作者在實(shí)驗(yàn)中仍需保持高度警惕，嚴(yán)格按照以下操作規(guī)范進(jìn)行：

1．使用慢病毒載體前請(qǐng)向您所在機(jī)構(gòu)的生物安全部門(mén)征得許可和指令。
2. 請(qǐng)?jiān)?BL2 生物安全二級(jí)生物安全柜中操作病毒粒子。
3. 請(qǐng)務(wù)必穿著實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性口罩和手套。
4. 小心操作，避免產(chǎn)生氣霧、飛濺或?yàn)⒙洹?br /> 5.被病毒污染的超凈工作臺(tái)，請(qǐng)立即用加入1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭干凈；請(qǐng)務(wù)必 將接觸病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液使用新配制的 10％漂、84 消毒液或
0.6%次氯酸鈉溶液浸泡1 小時(shí)以上再丟棄。
6. 裝盛慢病毒的實(shí)驗(yàn)用品需單獨(dú)放置及培養(yǎng)，并加以標(biāo)示。
7.用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時(shí)，請(qǐng)先擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板，用 70%乙醇擦拭培養(yǎng) 瓶外壁后，顯微鏡下觀察拍照。觀察完畢，請(qǐng)用70%乙醇再次擦拭顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺(tái)。
8. 離心病毒時(shí)，應(yīng)使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后進(jìn)行離心，請(qǐng)盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。
9. 實(shí)驗(yàn)完畢脫掉手套后，請(qǐng)立即用肥皂和水清洗雙手。
10.對(duì)共用實(shí)驗(yàn)室的人員需進(jìn)行慢病毒安全培訓(xùn)或提示。

（二）慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)
不同的細(xì)胞所使用的病毒 MOI 值會(huì)有所不同。建議在正式實(shí)驗(yàn)前，在目的細(xì)胞中進(jìn)行 預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索佳MOI 值(維真生物）。
為了節(jié)省病毒，推薦使用96 孔板進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。操作步驟如下：

1. 天 細(xì)胞的準(zhǔn)備
將目的細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞融合率為 50%為佳。為保證細(xì)胞生長(zhǎng)良好，請(qǐng)保 證細(xì)胞貼壁過(guò)夜。
2. 第二天 病毒的稀釋
取10μL 慢病毒原液加入 90μL 培養(yǎng)液中做1:100 稀釋?zhuān)?0-2），以此為起點(diǎn)做梯度稀 釋直至稀釋10-7?？筛鶕?jù)實(shí)際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。
3. 第二天 感染目的細(xì)胞
取出提前準(zhǔn)備好的96 孔板，用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)液，注意保留未加入病 毒的細(xì)胞孔作為對(duì)照組。
4. 第二至十天 觀察熒光或檢測(cè)
慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染較慢，請(qǐng)?jiān)诟腥炯?xì)胞后 48、72、96、120小時(shí)分別觀察細(xì)胞中熒光 表達(dá)情況（如果您選擇的產(chǎn)品不帶有熒光標(biāo)簽，請(qǐng)?jiān)?48、72、96、120小時(shí)分別收獲細(xì) 胞并通過(guò) Western-Blot 或其他檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)）。
注意事項(xiàng)：由于不同細(xì)胞對(duì)慢病毒感染過(guò)程的承受能力不同，在加入病毒稀釋液后，
請(qǐng)于 12-24 小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)以確認(rèn)加入的病毒量是否合適。

（三）慢病毒滴度測(cè)定
維真生物慢病毒單位為T(mén)U/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。 如：病毒滴度為>1×108 TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108個(gè)具有生物活性的慢病毒顆粒。
慢病毒的病毒滴度（TU/mL）可根據(jù)熒光蛋白在HEK293細(xì)胞中表達(dá)量確定，具體操作步驟如下：

1. 天 細(xì)胞的準(zhǔn)備
在96孔板中的每個(gè)孔中接種1-4×104個(gè) HEK293細(xì)胞。
2．第二天 病毒的稀釋和感染。在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋。稀釋方法為：每種病毒準(zhǔn)備8個(gè)1.5mLEppendorf 管，每管加入297μL完全培養(yǎng)液，向個(gè)管中加入33μL病毒原液，混勻后，吸取 30μL加入第二個(gè)管混勻。依此類(lèi)推，做8個(gè)稀釋度（10~10-6）。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)液，每個(gè)稀釋度重復(fù)3個(gè)孔，每孔加入含稀釋好的病毒液100μL。并做好標(biāo)記。
1. 第五天 熒光計(jì)數(shù)和滴度計(jì)算
用熒光顯微鏡對(duì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)出后兩個(gè)能觀察到熒光的孔內(nèi)的熒光細(xì) 胞數(shù)，計(jì)算3個(gè)重復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計(jì)算出平均數(shù)，假設(shè)為A（倒數(shù)第二個(gè)能見(jiàn)熒光 孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）和B（倒數(shù)個(gè)能見(jiàn)熒光孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）。 慢病毒病毒滴度計(jì)算公式：
病毒滴度(TU/mL) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）

（四）慢病毒感染目的細(xì)胞
進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí)可使用完全培養(yǎng)液（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋。培養(yǎng)液中的血 清、雙抗或其他營(yíng)養(yǎng)因子不會(huì)影響慢病毒的感染效率。
以24 孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行 HEK293 細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)按照不同的 MOI 設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI 和細(xì)胞數(shù)量計(jì) 算所需要的病毒量。

1. 天 細(xì)胞的準(zhǔn)備
在24 孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個(gè)孔內(nèi)接種 3-5×104 個(gè)HEK 293 細(xì)胞，鋪板時(shí)細(xì)胞的 融合率為 50%左右，每孔培養(yǎng)液體積為 300μL，進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞的融合率約為70%左右。
2. 第二天 病毒的準(zhǔn)備
根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況和 MOI 值，用培養(yǎng)液準(zhǔn)確稀釋慢病毒原液。 注意事項(xiàng)：可使用PBS 緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋病毒原液。
3. 第二天 感染目的細(xì)胞
在目的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液， 混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）孵育過(guò)夜。

注意事項(xiàng)：
1）感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對(duì)終的感染效果高低影響很大，請(qǐng)務(wù)必保證加入病毒前， 細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
2）若慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染效率較低，可通過(guò)提高 MOI 值提高病毒的感染效率，也可在培養(yǎng)液中加入助感染試劑 ADV-HR（詳見(jiàn)附錄 1、附錄 4、附錄 5）來(lái)提高病毒的感染效率。
4. 第三天 換培養(yǎng)液
病毒感染細(xì)胞 24 小時(shí)后，換培養(yǎng)液。 注意事項(xiàng)：換液具體時(shí)間需視細(xì)胞狀態(tài)而定。如果慢病毒對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用，影 響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，短可于加病毒 4 小時(shí)后換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 第六天 感染效率檢測(cè) 在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，計(jì)算慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。如選擇的慢病毒載體 不帶有熒光標(biāo)記，可以通過(guò) Q-PCR(定量 PCR)檢測(cè)目的基因的表達(dá)來(lái)評(píng)估感染效率。

注意事項(xiàng)：
1）慢病毒表達(dá)較慢，熒光表達(dá)所需時(shí)間較長(zhǎng)，建議感染96 小時(shí)后觀察熒光的表達(dá)。
2）感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過(guò)觀察熒光表達(dá)的時(shí)間和強(qiáng)度來(lái)確定慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染情況。
3）感染期間，請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的情況及時(shí)換液，以保證細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀