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膠回收和PCR產(chǎn)物回收技巧

發(fā)布時(shí)間:2021-08-06瀏覽次數(shù):1013返回列表

1.提高膠回收量的技巧

1)增加電泳時(shí)的上樣量。

2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。

3) 切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠,減小切膠體積:含目的片斷很少的膠就不要要了,不然影響回收率。

4) 把切的兩塊或多塊膠融化后,無論多大的體積都用一個(gè)管子,轉(zhuǎn)移到同一個(gè)柱子上。

5) 溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn),這樣有利于DNA與膜的結(jié)合,不過一般不要多余750ul。

6) 膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性(電荷)和疏水性使DNA與柱子結(jié)合,因此,若電泳緩沖液的PH偏高,可在溶膠液中加入10ul(PH 5.0,3mol/L的 NaAC);為了使DNA分子 好 的攔截在膜上,可以添加30%異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。

7) 加洗脫液之前,將柱子在室溫放置幾分鐘(大約需10分鐘),以使乙醇充分揮發(fā)。

8)后少加些洗脫液,盡量減少回收體積,一般用30-50μl洗脫液洗脫(不能太少,否則無法浸濕膜反而不利于洗脫);洗脫液滴在膜中央,以充分洗脫結(jié)合在 膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脫液之后,可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫,或用封口膜密封4度過夜,第二天再離心回收,效果不錯(cuò)。

10)將離心后的洗脫液加回吸附柱,再次離心。

2. PCR 產(chǎn)物回收的詳細(xì)方法和步驟

1)普通膠回收

如果要膠回收,好還是用試劑盒,方便,回收率也略高,實(shí)在要手工回收,可以切膠后加入3倍體積TE,水浴熔化后,酚、酚/抽提干凈,乙醇沉淀 即可。

2)從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA

純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA ),置65℃水浴5分鐘保溫,使凝膠完全溶解。待放至室溫,加等量酚(TE飽和,TE封在上層,取下層酚),輕輕混勻(不用混 勻),12000rpm,3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液,加0.1體積3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積無水乙醇,進(jìn)行乙醇沉淀。將 純化的DNA加適量TE溶解,測定含量,備用(可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析,探針 制備等)。

3)擴(kuò)增特異性好的PCR回收

如果PCR擴(kuò)增特異性好,只是簡單的PCR產(chǎn)物純化回收,可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug/ml 的蛋白酶K,37度1h,酚/抽提一次,抽提一次,上清加入0.1體積的醋酸鈉,2.5體積的無水乙醇沉淀回收

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