一、蛋白marker是什么？

在WB實驗中，蛋白marker的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應(yīng)的分子量大小，只有標準量無誤了，實驗結(jié)果才有說服力，除此之外，蛋白標準還有表示轉(zhuǎn)移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用，所以選擇正確的蛋白Marker也是western blot實驗成功的必要條件之一。

二、蛋白marker的分類

總體來說，蛋白Marker可以分成未預(yù)染蛋白marker、預(yù)染marker二個級別。

1. 未染色（pre mixed）蛋白分子量標準

未預(yù)染蛋白marker即寬分子量蛋白標準、高分子量蛋白標準以及低分子量蛋白marker。

未染色的蛋白分子量標準是簡單，也是準確的一種。由于沒有附帶染料分子或者是標記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是判斷蛋白大小必須的?，F(xiàn)在的Marker多數(shù)都選用預(yù)混和的Marker，方便不同大小的蛋白比較。預(yù)混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，因為混合的條帶越多，越不好記，所以當看到特別濃的那幾條可以作為標志帶。不過小帶通常都不那么容易看清楚。在選擇上來說，當然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的好，越近越好。預(yù)混的Marker使用上不如預(yù)染Marker（pre-stained）好用，因為電泳過程中完全看不到，要和目標蛋白一起等到后染色才可以看到，無法對實驗起預(yù)示參照作用。完全屬于“后知后覺”型的。

① 寬分子量蛋白標準

如果從實驗室總體考慮的，就選范圍盡量寬，條帶分布比較均勻的，這樣你的蛋白無論在哪個區(qū)間都容易判斷，避免正好落在一段空白區(qū)。不過條帶越多，相應(yīng)的上樣量也會增加。拿到Marker后，如果買的是大包裝，就應(yīng)該考慮分裝，避免多次反復(fù)凍融。另外寬譜的Marker不一定每條都能看到的，特別是Mini Cell。如果側(cè)重大蛋白，那小的可能就已經(jīng)跑掉了。

② 高分子量蛋白標準

通常在檢測大分子量蛋白經(jīng)常使用到高分子量蛋白標準

③ 低分子量蛋白標準

在一般的蛋白電泳當中，常用的是低分子量蛋白標準，除了有指示蛋白大小的作用以外，有時還可以用作粗略的定量。實驗室用在一般蛋白電泳的低分子量蛋白標準中。

在低分子量蛋白標準這里還包括可特別小的蛋白標準，比如30kD以下蛋白或者多肽的分離辨別。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白標準挺不錯，另外特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色好，上樣一定要上足夠的量。

2.預(yù)染蛋白分子量標準

預(yù)染蛋白分子量是一些純化好的蛋白混合物，通過與染料共價耦聯(lián)，在電泳過程中或者轉(zhuǎn)膜時可以直接觀察到。預(yù)染蛋白分子量的出現(xiàn)方便了我們的實驗，這種蛋白分子量標準可以幫助我們在電泳時、電泳后，以及轉(zhuǎn)膜后監(jiān)測電泳情況和估計遷移率——比如，已知垂直電泳佳分辨區(qū)域大約在膠的2/3處，如果使用預(yù)染Marker就可以預(yù)測目標蛋白進入佳分辨區(qū)時停止電泳以得到佳分辨效果；如果觀察到Marker電泳異常也可以及時終止電泳；另外在Western Blot轉(zhuǎn)膜以后可以直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜是否完全，還可以在膜上標記蛋白分子量，所以吸引了許多實驗室人員購買預(yù)染蛋白標準。值得注意的是預(yù)染蛋白Marker與染料共價耦聯(lián)，所以在不同的緩沖條件下電泳時遷移特性可能會發(fā)生某些變化，可能導(dǎo)致一些偏差，所以不太適合定位蛋白——不過多數(shù)情況下Marker的條帶未必能和我們的目標蛋白完全一樣，我們得到的也不過是一種相對Marker指示的參考大小，后都需要Western來定性，所以如果不是要區(qū)分大小相近的條帶，預(yù)染Marker還是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白標準一起使用。

預(yù)染蛋白標準可以分為兩種：單色預(yù)染和多色預(yù)染，其實區(qū)別就在于幫助在實驗過程中辨認某個條帶的大小——Marker條帶越多參考價值越大，可就越難辨認區(qū)分，如果用不同的顏色來區(qū)別就比較好辨認；單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小的。還有一點特別要注意，由于轉(zhuǎn)膜是一個將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上，所以需要的上樣量相對少一些，如果想要在電泳過程中看到美麗的“彩虹”，或者單色的Marker往往需要比說明書里多加一些Marker的。

三．Western專用的標記蛋白marker

①生物素標記蛋白標準

未染色的Marker在做Western時，需要在印跡前先用麗春紅或者是SYPRO熒光蛋白染色液等不干擾Western Blot的染色方法顯色，在膠上做標記后才能“拼”在后的結(jié)果中，如果是預(yù)染的Marker就要在轉(zhuǎn)膜后標記膜，或者剪膜，后在“拼上”。要是想直接將Marker結(jié)果顯示在后結(jié)果上，不用手工作圖或者拼接，那就要Western專用的Marker了。比如生物素標記的蛋白標準。這種方法主要是配合化學發(fā)光法：在蛋白分子量上標記生物素，通過帶有抗生物素的抗體或者偶聯(lián)鏈親霉素的抗體，在化學發(fā)光檢測到目的蛋白帶時就可以同時看到相應(yīng)的分子量標準一起發(fā)光顯影了。不同于普通蛋白分子量標準的便宜、預(yù)染蛋白分子量的方便，這一方法的優(yōu)點是與Marker和目的蛋白對應(yīng)性好，同時在同張片上顯示，不用拼接，利于分析。缺點是如果樣品中帶有生物素背景，那個抗生物素抗體有可能影響結(jié)果，而且反應(yīng)體系太過復(fù)雜也會干擾實驗結(jié)果。

②特殊標記蛋白標準

在經(jīng)過修飾的蛋白標準中，除了生物素標記以外，近些年由于下游蛋白操作的豐富化與復(fù)雜化，也出現(xiàn)帶有“尾巴”的蛋白標準。比如His-Tag，如果每個Marker條帶都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗體很容易將Marker條帶顯示在Western結(jié)果上。很方便，問題就是有可能有潛在的干擾，比如樣品中正好有類似Histag的結(jié)構(gòu)。不過這可以通過對照檢測的。