1、抗原提純與動物免疫

對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細胞抗原，可取1×107個細胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖杓油耆Ｊ献魟┎⒔?jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。

選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，雌雄不限。為避免小鼠反應(yīng)而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫3～4只小鼠。

免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為終目的。免疫間隔一般2～3周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產(chǎn)生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關(guān)。末次免疫后3～4天，分離脾細胞融合。

2、骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備

選擇瘤細胞株的重要的一點是與待融合的B細胞同源。如待融合的是脾細胞，各種骨髓瘤細胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細胞的高生長刻度為9×105/ml，倍增時間通常為10～15h。融合細胞應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)和活性佳的細胞（活性應(yīng)大于95％）。骨髓瘤細胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為2 ×105/ml，次日一般即為對數(shù)生長期細胞。

在體外培養(yǎng)條件下，細胞的生長依賴適當?shù)募毎芏?，因而，在培養(yǎng)融合細胞或細胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細胞（feeder cell）。常用的飼養(yǎng)細胞為小鼠的腹腔細胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細胞，其中在巨噬細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞作為飼養(yǎng)細胞的。

在制備飼養(yǎng)細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會有嚴重污染。飼養(yǎng)細胞調(diào)至1×105/ml，提前一天或當天置板孔中培養(yǎng)。

3、細胞融合

細胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后吧培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有幾個問題應(yīng)特別注意。①細胞比例：骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。②反應(yīng)時間：在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分：對融合細胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時核查培養(yǎng)基情況。

4、有限稀釋法

篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株，所以只有融合的細胞才能待續(xù)存活一周以上。融合細胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個細胞/孔），按Poisson法計算，應(yīng)有36％的孔為1個細胞/孔。細胞培養(yǎng)至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾后進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞株擴大培養(yǎng)或凍存。

5、單克隆抗體的制備和凍存

篩選出的陽性細胞株應(yīng)及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細胞的數(shù)量應(yīng)適當，一般為5×105/鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當增減。

選出的陽性細胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應(yīng)用的凍存保護劑。凍存細胞復(fù)蘇后的活性多在50％～95％之間。如果低于50％，則說明凍存復(fù)蘇過程有問題.

6、單克隆抗體的純化

單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體（常用Sepharose）交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達90％以上。蛋白可與IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合，同時還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時，1.44（吸光單位）相當于1mg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對保持純化抗體的活性至關(guān)重要