蛋白含量測定方法-Bradford法（考馬斯亮藍法）

  原理：這一方法基于考馬斯亮藍G-250有紅藍兩種不同的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng)化合物在465-595nm處有zui大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系，因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量。

  試劑：

  （1）標準蛋白質(zhì)溶液，牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。

  （2）考馬斯亮蘭G―250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。

  實驗方法：

  （1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。zui后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G―250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。

  （2）加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG―250試劑。

  注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。

  （3）用標準蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

    0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。

  特點：

  （1）靈敏度高，其zui低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大得多。

  （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5min左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程大約只要2min即可完成，其顏色可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5min～20min之間，顏色的穩(wěn)定性，因而*不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

  （3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子，Tris緩沖液，蔗糖，甘油，巰基乙醇，EDTA等均不干擾此測定法。

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