植物總DNA的快速少量抽提(CTAB法)@古朵資訊

  實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?

  了解植物DNA抽提的主要方法，掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。

  實(shí)驗(yàn)材料及試劑：水稻葉片，1.5×CTAB，/異戊醇(24:1)，95%乙醇或無水乙醇等

  實(shí)驗(yàn)原理：植物DNA的抽提常采用兩種方法：

  (1)SDS法： 離子去污劑，過程長(zhǎng)，純度高;

  (2)CTAB法：該方法簡(jiǎn)便、快速，DNA產(chǎn)量高(純度稍次，適用于一般分子生物學(xué)操作)。 CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65°C水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽(>0.7mM)濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用70-75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。再經(jīng)過/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA，后經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分離出來。

  植物總DNA的快速少量抽提實(shí)驗(yàn)步驟：

  1.采集適量幼嫩葉片，用液N2研成粉末，0.4 g裝入1.5ml離心管中(-20℃預(yù)冷)。

  2.預(yù)熱1.5×CTAB到95℃，加1ml到裝有葉片粉末的離心管中，混勻(防止凍融)。

  3.立即置于65℃水浴30min，每5分鐘，上下顛倒1次。

  4.12000g離心5分鐘。

  5.吸取上清液約600μl，加入等體積(600μl)/異戊醇(24:1)，上下顛倒數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止。

  6.12000g離心5分鐘。

  7.取450μl上清于一新1.5ml離心管，加入1ml 95%乙醇和45μl 10M NH4AC)，混勻，室溫放置10min。

  8.12000 g離心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥約30 min。

  9.加入50μl 1/10 TE或無菌水(含20μg/RNase)，置于4℃過夜，待DNA溶解后，檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。

  植物總DNA的快速少量抽提注意事項(xiàng)：

  1.盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用10 mM的β-ME處理

  2.研缽預(yù)凍，粉末至加CTAB前不要融化

  3.24:1的/異戊醇抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭好是剪寬了的

  4.所用試劑必需滅菌，手套

  植物總DNA的快速少量抽提 上海古朵生物科技有限公司，由具有資深行業(yè)背景和豐富市場(chǎng)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人士組成，致力于為生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供產(chǎn)品，為廣大科研工作者提供服務(wù)。既能滿足研發(fā)類客戶對(duì)產(chǎn)品種類、包裝、純度的特殊要求，也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a(chǎn)各個(gè)階段的綜合需求。產(chǎn)品涵蓋有機(jī)試劑、無機(jī)試劑和生化試劑，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、天然植物提取物及中藥標(biāo)準(zhǔn)品，核酸、酶、緩沖劑、顯色底物，醫(yī)藥中間體、原料藥、催化劑、高純?nèi)軇?、特種高分子材料及實(shí)驗(yàn)室常用耗材。品種類超過2萬種，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞藥理、藥劑、分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域。