免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)

  一、免疫熒光的標(biāo)本制作的基本程序同DAB顯色的免疫組化，不同點(diǎn)如下：

  1. 免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同。

  2. 免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育，孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。

  3. 二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。

  4. 免疫熒光在封片使用專(zhuān)用封片劑或甘油：0.01MPBS (1：1)。

  5. 條件許可可以購(gòu)買(mǎi)防淬滅的試劑加入封片劑中，標(biāo)本可以保存久。

  6. 熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要閉光。

  7. 熒光抗體染色假陽(yáng)性可能會(huì)多，需要設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

  二、注意事項(xiàng)

  1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱。

  2. 每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：

  (1) 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物

  (2) 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物

  (3) 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物

  三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談

  1. 選取primary antibodies時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物，用來(lái)源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，用donkey anti-rabbit-FITC(綠)和donkey anti-rat-Tex-Red(紅)。

  2. 我的做法是兩種primary antibodies同時(shí)孵育，然后兩種secondary antibodies同時(shí)孵育?？贵w濃度、孵育時(shí)間要認(rèn)真摸索，感覺(jué)primary antibodies 4度孵育過(guò)夜比較好，背景比較干凈。

  3. 我的陽(yáng)性對(duì)照采用的是陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。

  4. Block用的血清使secondary antibody來(lái)源動(dòng)物的血清，我的是10%正常donkey血清。

  5. 其余同一般操作。

  免疫熒光雙標(biāo) 古朵 上海古朵生物科技有限公司，由具有資深行業(yè)背景和豐富市場(chǎng)經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人士組成，致力于為生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供產(chǎn)品，為廣大科研工作者提供服務(wù)。既能滿(mǎn)足研發(fā)類(lèi)客戶(hù)對(duì)產(chǎn)品種類(lèi)、包裝、純度的特殊要求，也能滿(mǎn)足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a(chǎn)各個(gè)階段的綜合需求。產(chǎn)品涵蓋有機(jī)試劑、無(wú)機(jī)試劑和生化試劑，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、天然植物提取物及中藥標(biāo)準(zhǔn)品，核酸、酶、緩沖劑、顯色底物，醫(yī)藥中間體、原料藥、催化劑、高純?nèi)軇?、特種高分子材料及實(shí)驗(yàn)室常用耗材。品種類(lèi)超過(guò)2萬(wàn)種，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞藥理、藥劑、分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域。