標簽：辣根過氧化酶 熒光多色標記試劑盒 古朵生物 多重同源抗體

  熒光多色標記試劑盒(五標六色)

  原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA， Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶 ( HRP) 對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法， 類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 ， TSA 技術同樣采 用 HRP 標記的二抗， 同樣有對應的 “顯色"步驟 (HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物， 產生 活化熒光底物， 活化底物可與抗原上的酪氨sua等殘基共價結合， 使樣品上穩(wěn)定的共價結合酪胺熒光 素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP 復合物， 重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育， 換另一種酪胺熒光素底物， 如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

  TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結合位點)， 產生大量的酶促產物， 該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨sua、 組氨sua和酪氨sua殘基)結 合， 這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積， 結果使其檢測信號得到 10-100 倍增強。 簡單 來說， 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯(lián)熒光素) ， 來催化后續(xù) 添加入體系的非活性熒光素。 熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化， 跟臨近蛋白的酪氨sua殘基 共價偶聯(lián)， 使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結合。 然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理， 前一輪非共價 結合的抗體被洗掉， 共價結合的熒光素穩(wěn)定共價結合在樣本切片蛋白上。 再換個一抗來第二輪孵育 ， 周而復始。 等到所有抗體孵育結束， 熒光素都結合好后， 后去檢測結果。 由于每次體系中都只有單 一抗體孵育， 因此無需擔心抗體交叉反應， 以及一抗二抗種屬匹配問題， 大大減少了實驗設計時不同 種屬抗體選擇匹配的限制。 也就是說， 如果用 TSA 技術， 同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。 搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進行實驗， 而且信號放大的倍數(shù)大大增強。 本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中以下一種或者多種： TYR-480， TYR-520， TYR- 570， TYR-620， TYR-690， TYR-780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。 可以實現(xiàn)單標、 雙 標、 三標以及多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能， 極大豐富了此試劑盒的內涵。

  試劑盒組成： TYR-520 熒光染料(綠光)(即用型， 5mL),-20℃; TYR-570 熒光染料 (紅光) (即用型， 5mL)， -20℃; TYR-620 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃; TYR-690 熒光染料 (即用型， 5mL)， - 20℃; TYR-780 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃; TSA+增強劑， 100ul， -20℃ (可選) ;

  高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (15mL) 4℃ (可選) 。

  備注： TYR-520 熒光染料 、TYR-570 熒光染料、 TYR-620 熒光染料、 TYR-690 熒 光染料、 TYR-780 熒光染料 在-20 度下， 均為固體， 使用之前需解凍。

  TSA+增強劑使用方法： TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號 5-10 倍， TSA+增 強劑： TYR 熒光放大液=1:500， 使用 TSA+增強劑不是必須的選項， 可以根據(jù)具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。

  熒光多色標記試劑盒(五標六色) 操作流程：

  1、 石蠟切片脫蠟至水： 依次將切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風廚內， 酒精晾干后放入自來水中稍洗， 蒸餾水洗。

  2、 抗原修復： 組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復 盒中于微波爐內進行抗原修復 (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復方法) 。 中火 8min， 停火 8min， 轉中低火 7min， 此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)， 切勿 干片。 自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 (修復液 和修復條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定) 。

  3 、 阻斷內源性過氧化物酶： 切片放入 3%過氧hua氫溶液， 室溫避光孵育 15 min， 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。

  4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) ， 在圈內滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織， 室溫封閉 30min。

  5、 加一抗： 輕輕甩掉封閉液， 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X， 切片平放于避光濕盒 內 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā))

  6、 加 hrp 二抗： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織， 避光室溫孵育 50min， PBS 洗三次。

  7、 熒光染料反應： TYRXXX 熒光染料反應 10-15min， PBS 洗三次。

  8、 重復 2-7 步驟 (換用另外一種 TYRXXX 熒光染料)

  9、 DAPI 復染細胞核： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內滴加 DAPI 染液， 避光室溫孵育 10min。

  10、 封片： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。

  11、 鏡檢拍照： 切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖 像。

  染料 激發(fā)波長 發(fā)射波長

  DAPI 藍色 350 420

  TYR-480 450 480

  TYR-520 綠色 490 520

  TYR-570 紅色 550 570

  TYR-620 590 620

  TYR-690 630 690

  TYR-780 750 780

  TSA+增強劑的用法： TSA+增強劑在 4 度或者-20 度是固體狀態(tài)， 使用之前需要解凍; 將增強劑按 比例加入到熒光反應工作液中， 反應信號提高 5-10 倍， 適用于信號比較弱的情況， TSA+增強劑不 是一定要加入到熒光反應液中， 是可選擇的， 根據(jù)具體情況而定， 具體使用方法： TSA+增強劑： TYR 熒光反應液=1:500

  文獻引用格式： Co-staining of A, B， C， D and E was performed using a Six-color multiple immunofluorescence Kit ( GuduoBio Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

  熒光多色標記試劑盒(五標六色)上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。