質(zhì)粒提取試劑盒中各溶液配方以及作用

  提質(zhì)粒是分子生物學(xué)中基本，easy的實(shí)驗(yàn)。wan全不需要借助大腦，直接照著提取試劑盒中的操作說明傻瓜操作即可(其實(shí)應(yīng)該由機(jī)器人在實(shí)驗(yàn)室中操作這些簡單卻耗時(shí)的實(shí)驗(yàn))。盡管操作簡單，提質(zhì)粒卻也是一個(gè)比較重要的步驟，提出質(zhì)粒的質(zhì)量和數(shù)量將直接決定著后續(xù)實(shí)驗(yàn)室的成敗。當(dāng)我們按照試劑盒中操作說明進(jìn)行操作時(shí)，我們會看到P1，P2，N3, PE，EB等不同的溶液(不同試劑盒可能標(biāo)識不同)。那么大家是否知道每瓶溶液中裝的什么?它們在質(zhì)粒提取過程中的作用又是怎樣的?古朵生物技術(shù)小編詳解如下：

  質(zhì)粒提取采用的是強(qiáng)堿裂解法(alkaline lysis)，那么我們現(xiàn)在來看一下溶液 P1 ， P2， N3, PE, EB都是什么。

  溶液1(P1)

  組分濃度 25 mM Tris-HCl(pH8.0)，10 mM EDTA，50 mM 葡糖糖(Glucose)

  溶液1的主要作用是將菌體沉淀懸浮起來。25mM Tris-HCl是緩沖溶液，保證反應(yīng)體系的pH恒定。EDTA是金屬離子螯合劑，10 mM EDTA的作用是與微生物體內(nèi)的金屬離子相互結(jié)合，抑制DNase的活性。50 mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉降的時(shí)間。溶液1在使用前通常要加入RNA酶(RNase A)，RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶屬于蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性很差，所以加了RNase A的溶液1需要低溫4oC保存。

  溶液2(P2)

  組份濃度 250 mM NaOH，1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)

  溶液2的主要作用是細(xì)胞裂解。溶液1將細(xì)胞懸浮后，就需要添加溶液2了，溶液2的作用就是對細(xì)胞進(jìn)行裂解。溶液2只包括兩種成分：氫氧/化鈉和SDS。真正起到到細(xì)胞裂解作用的是氫氧/化鈉，這也是為什么這個(gè)方法會被叫做堿裂解法。氫氧/化鈉會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使之發(fā)生bilayer(雙層膜)結(jié)構(gòu)向micelle(微囊)結(jié)構(gòu)的相變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞的裂解。SDS的作用將在下一步提到。添加溶液2后需要注意的一個(gè)是時(shí)間一定不能過長，另一個(gè)是不可以劇烈震動離心管。時(shí)間過長以及劇烈震動都將導(dǎo)致氫氧/化鈉破壞基因組DNA，斷裂的基因組DNA碎片將會與相似大小質(zhì)粒一同被抽提，污染樣品。

  溶液3(N3)

  組份濃度 3M cu酸鉀(potassium acetate)，5M 醋酸

  溶液3的主要作用是中和第二步加入的強(qiáng)堿以及清除掉蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)。N是neutralized的縮寫。強(qiáng)堿溶液氫氧/化鈉長時(shí)間與DNA基礎(chǔ)會破壞其結(jié)構(gòu)，因此需要進(jìn)行中和。中和氫氧/化鈉，5 M醋酸就足夠了，為何又要加入cu酸鉀呢?做過質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)的同學(xué)應(yīng)該記得，在加入溶液N3后，會有大量沉淀出現(xiàn)。這些沉淀其實(shí)cu酸鉀與溶液2中的SDS相互作用，反應(yīng)生成的十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate, PDS)。加入溶液N3后，SDS遇到鉀離子，生成PDS不溶于水，會迅速發(fā)生沉淀。

  那么溶液3的加入是如何清除掉蛋白質(zhì)，基因組DNA等雜質(zhì)的呢?道理是，溶液2中加入的十二烷基硫酸鈉(SDS)很容易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸就會結(jié)合一個(gè)SDS分子，二者結(jié)合會形成SDS2多肽復(fù)合體，這樣變性蛋白質(zhì)將溶解在溶液中，從而使得多肽鏈好地與基因組DNA纏繞。加入溶液3后，由于十二烷基硫酸鹽與變性蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合體，十二烷基硫酸鉀的沉淀就將變性的蛋白質(zhì)一起沉淀，同時(shí)變性的蛋白質(zhì)與基因組DNA纏繞，結(jié)果也大部分被共沉淀了。而高離子濃度的溶液又加速了這一沉淀過程。此外，溶液被中和后變性蛋白質(zhì)表面電荷減少,也可以促進(jìn)變性蛋白質(zhì)沉淀。

  溶液PE (wash buffer)

  組分濃度10 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 80 % 乙醇(Ethanol)

  Wash buffer的作用主要是清洗掉多余的鹽離子。試劑盒中都是利用硅膠柱進(jìn)行DNA提取的。在DNA與硅膠柱吸附后，需要利用Wash buffer清洗掉多余的鹽離子。Wash buffer中含有高濃度的乙醇，由于乙醇會影響后續(xù)的酶切或測序反應(yīng)，在洗脫DNA前必須要在離心機(jī)內(nèi)"空甩"柱子，wan全清除掉乙醇。

  溶液EB(Elution buffer)

  組分濃度10 mM Tris-HCl (pH 7.5)

  EB的作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。Elution buffer中不能含有過高濃度的鹽離子，因?yàn)樵诟啕}環(huán)境中，鹽陽離子會打破硅膠負(fù)氧根和水之間的氫鍵，使得整體的硅膠攜帶正電，會吸引攜帶負(fù)電的DNA分子。另外，加熱過的洗脫液(<50°C)可以加速DNA從硅膠膜上脫離下來。另外，離心前保持EB緩沖液在膜上停留時(shí)間長一些，將有利于DNA的洗脫。

  不同公司的質(zhì)粒提取試劑盒中溶液成分可能有所差異，比如P1中可以去除掉葡萄糖，溶液PE甚至可以直接用水來代替等等。質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中的基本且重要的實(shí)驗(yàn)，盡管實(shí)驗(yàn)本身簡單，但其原理還是有些復(fù)雜的。小編相信，知其然亦要知其所以然，清楚實(shí)驗(yàn)的原理，當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題之時(shí)，會能夠容易找到原因并給予糾正。

  質(zhì)粒提取試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。