古朵生物：脂質體轉染的原理與步驟詳解

  1、細胞傳代

  1)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

  2)用移液槍加入1ml胰酶，消化1min(37℃，5% CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。

  3)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。

  4)用移液槍多次吹吸，使細胞完全分散開。

  5)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

  6)用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8 x 106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。

  7)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

  8)將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。

  2、細胞轉染

  1)轉染試劑的準備

  A、將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10s，溶解脂狀物。

  B、震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩。

  2)選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積ul：DNA質量ug)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

  3)將混合液在室溫放置10-15min。

  4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

  5)加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

  6)到時間后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。

  3、第二次細胞傳代

  1)在轉染后24h，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

  2)再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8 x 105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新分入培養(yǎng)皿中。

  3)在正常條件下培養(yǎng)24h后，按照染色要求條件固定。

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