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公司名稱:上海古朵生物科技有限公司
聯(lián)系人:洛辰
電話:18321664727
手機(jī):13621980056
郵件:2712232205@qq.com
地址:上海市嘉定區(qū)曹安公路5588號(hào)
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手機(jī)站:http://m.fkbio-sh.com
技術(shù)支持:熒光單標(biāo)信號(hào)放大試劑盒
發(fā)布時(shí)間:2023-08-07瀏覽次數(shù):875返回列表
熒光單標(biāo)信號(hào)放大試劑盒
原理介紹: 酪酰胺信號(hào)放大(TSA,Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過(guò)氧化酶(HRP)對(duì)靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法,類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法 ,TSA技術(shù)同樣采用HRP標(biāo)記的二抗,同樣有對(duì)應(yīng)的“顯色”步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物,產(chǎn)生活化熒光底物,活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價(jià)結(jié)合,使樣品上穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價(jià)結(jié)合的一抗-二抗-HRP復(fù)合物,重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來(lái)第二輪孵育,換另一種酪胺熒光素底物,如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。
TSA詳細(xì)原理是利用酪胺Tyramide的過(guò)氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)),產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物,該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合,這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積,結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到10-100倍增強(qiáng)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素),來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化,跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián),使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理,前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉,共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育,周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束,熒光素都結(jié)合好后,后去檢測(cè)結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育,因此無(wú)需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng),以及一抗二抗種屬匹配問(wèn)題,大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說(shuō),如果用TSA技術(shù),同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn),而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為一下其中一種或者多種:TYR-480,TYR-520,TYR-570,TYR-620,TYR-690,TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用??梢詫?shí)現(xiàn)單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能,極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。
試劑盒組成:TYR-520熒光染料(綠光)(即用型,5mL),-20℃ ;
TSA+增強(qiáng)劑,10ul, -20℃(可選)
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(5mL) 4℃。
備注:TYR-520熒光染料在-20度下 ,均為固體,使用之前需解凍。
TSA+增強(qiáng)劑 使用方法:TSA+增強(qiáng)劑 能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)放大液的放大信號(hào)5-10倍,TSA+增強(qiáng)劑:TYR熒光放大液=1:500,使用TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項(xiàng),可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。
操作流程:
1 石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ。取出放在通風(fēng)廚內(nèi),酒精晾干后放入自來(lái)水中稍洗,蒸餾水洗。
2 抗原修復(fù):組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法)。中火8min,停火8min,轉(zhuǎn)中低火7min,此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來(lái)確定)。
3 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:切片放入3%過(guò)氧化氫溶液,室溫避光孵育15 min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。
4 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內(nèi)滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。
5 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))
6 加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min,PBS洗三次。
7 熒光染料反應(yīng):TYRXXX熒光染料反應(yīng) 2min-10min,PBS洗三次。
8 重復(fù)2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)
9 DAPI復(fù)染細(xì)胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。
10 封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
11 鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。
染料 |
激發(fā)波長(zhǎng) |
發(fā)射波長(zhǎng) |
DAPI 藍(lán)色 |
350 |
420 |
TYR-480 |
450 |
480 |
TYR-520綠色 |
490 |
520 |
TYR-570紅色 |
550 |
570 |
TYR-620 |
590 |
620 |
TYR-690 |
630 |
690 |
TYR-780 |
750 |
780 |
文章引用試劑盒/方法:Staining of A was performed using a Two-color Immunofluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) ba
ELISA試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品,勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū),我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向,不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品,提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。