四色多重免疫熒光試劑盒Plus(兔鼠通用二抗)
 

  原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA ，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶 蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 ，TSA 技術(shù)同樣采用 HRP 標記的二 抗，同樣有對應的“顯色 ”步驟(HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底 物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復法或者抗體 洗脫液洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP 復合物，重復下一種一抗-hrp 二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒 光素底物，如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

  TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide 的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結(jié)合位 點) ，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在 抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測信號得到 10- 100 倍增強。簡單來說，用這種方法 做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒 光素。熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒 光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒 光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒 光素都結(jié)合好后，后去檢測結(jié)果。 由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應， 以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用 TSA 技術(shù)，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以 進行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多 種：TYR-480Plus ，TYR-520Plus ，TYR-570Plus ，TYR-620Plus ，TYR-690Plus ，TYR-780Plus 。此試劑盒中 的熒光染料可單獨或配合使用?？梢詫崿F(xiàn)單標、雙標、三標以及多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等 功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

  四色多重免疫熒光試劑盒 試劑盒規(guī)格：100T

  儲存溫度：4 度，一年有效

  試劑盒組成：

  名稱貨號規(guī)格保存條件

  TYR-520Plus 熒光染料RC001濃縮型，50ul ，200x4℃

  TYR-570Plus 熒光染料RC002濃縮型，50ul ，200x4℃

  TYR-690Plus 熒光染料RC004濃縮型，50ul ，200x4℃

  TSA bufferRCB008624mL4℃

  HRP 山羊抗兔/鼠通用二抗RCB05415mL4℃

  Dapi 染液(即用型)RC0510mL4℃

  抗體稀釋液RCT00240mL4℃

  3%過氧化氫RC01240mL4℃

  染料使用方法：TSA 熒光染料反應液 =TYR-xxxPlus 熒光染料+TSA buffer;TYR-xxxPlus 熒光染料：TSA buffer=1：200;TYR-xxxPlus 熒光染料與 TSA buffer 的稀釋比例可以根據(jù)具體情況靈活調(diào)整優(yōu)化，佳范圍為 1:50-- 1:400(1:200 大部分情況能得到佳結(jié)果);一般建議若一抗孵育時間常溫 1h-3h 內(nèi)，建議稀釋比例 1:50- 1:200, 若一抗孵育時間 4 度過夜(12h 或以上)，建議稀釋比例 1:200- 1:400 或高。

  詳細操作步驟

  1 、樣本準備：

  1)石蠟切片：依次將切片放入二甲bⅠ15min-二甲bⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇 5min-85%乙醇 5min-75%乙醇 5min ，蒸餾水洗。

  2)冰凍切片：冰凍切片固定 10-30min，PBS 洗 5min，重復 3 次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透 20min，PBS 洗 5min ，重復 3 次。

  3)細胞爬片或者細胞涂片：細胞樣本固定 10-30min ，PBS 洗 5min 重復 3 次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透 20min ，PBS 洗 5min ，重復 3 次。

  2、抗原修復：組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于 微波爐內(nèi)進行抗原修復(也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min 等其他熱修復方法)。中 火 8min ，?；?8min ，轉(zhuǎn)中低火 7min ，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。 自然冷卻后將玻片置 于 PBS(PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。(修復液和修復條件根據(jù)組織類型以及抗原類 型來確定，冰凍切片和細胞樣本可省略此步驟)。

  3 、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入 3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育 15 min ，將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。

  4 、非特異性靶點封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用抗體稀釋液(或者其他封閉液 3%BSA 或者山羊血清)均勻覆蓋組織，室溫封閉 30min 。額外說明：抗體稀釋液內(nèi)含有各種保護劑以及防腐劑，可以用來封閉 或者 稀釋一抗，稀釋后的一抗可以長期四度保存(在常溫下也可以保存一個月之久)

  5 、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X ，切片平放于避光濕盒內(nèi) 4°C孵育過夜或者 37 度 1-2h(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā));

  6 、加 hrp 二抗：玻片置于 PBS(PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈內(nèi) 滴加與一抗相應種屬的 hrp 二抗覆蓋組織，避光室溫孵育 50min ，PBS 洗三次。額外說明：本試劑盒內(nèi)自帶 的 hrp 山羊抗兔/鼠通用二抗為即用型，具有超高靈敏度，隨時可用，無需配置。

  7 、TSA 熒光染料反應液反應：濃縮型熒光染料與 TSA buffer 按照 1:50- 1:200 的比例混合均勻，切片滴加配 好的 TSA 熒光染料反應液均勻覆蓋組織室溫反應 1- 15min(佳時間 5min- 10min)，PBS 洗三次(預實驗 可先染 1min洗干凈熒光染料后顯微鏡下觀察染色效果，如果陽性弱繼續(xù)滴加熒光染料加強染色強度直至合適強度后繼續(xù)進行下一步)。

  8 、抗體洗脫：石蠟切片置于抗原修復液中 95 度水浴 25-40min(根據(jù)不同抗體親和力 靈活調(diào)整時間)或者 滴加適量 37 度預熱至完全溶解的mIHC 專用抗體洗脫液(冰凍切片 爬片 骨組織建議用)覆蓋樣本，37 度放置 5-20 分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本 37 度放置 5-20 分鐘，棄洗脫液，PBS 洗三次，每次 5 分鐘(石蠟切片可用熱修復洗脫或者抗體洗脫液洗脫，細胞及冰切切片需用抗體洗脫液進行洗脫)

  9 、 重復 3-8 步驟(換用另外一種 TYR-XXXPLus 熒光染料)---第二輪標記

  10 、重復 3-8 步驟(換用另外一種 TYR-XXXPLus 熒光染料)---第三輪標記

  11、重復 3-7 步驟(換用另外一種 TYR-XXXPLus 熒光染料)---第四輪標記

  12、DAPI 復染細胞核：玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加 DAPI 即用型染液，避光室溫孵育 5min-20min。

  13 、封片：玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片(我司有相應產(chǎn)品)。

  14 、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

  染料激發(fā)波長發(fā)射波長

  DAPI 藍色350420

  TYR-480Plus450480

  TYR-520Plus 綠色490520

  TYR-570Plus 紅色550570

  TYR-620Plus590620

  TYR-690Plus630690

  TYR-780Plus750780

  四色多重免疫熒光試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務質(zhì)量"的方針。