間接免疫熒光法檢測自身抗體

  自身抗體診斷的標準技術是間接免疫熒光法，其特點是特異性強，陽性與陰性樣品的信號強度對比明顯，通過顯微鏡觀測能夠地判斷組織或細胞內(nèi)熒光的分布。自身抗原的位置決定了其相應抗體的典型的熒光模式，所有與此典型模式不相關區(qū)域的染色被認為是非特異性染色。即使偶爾伴有強的非特異性染色，但弱的特異性信號也能夠被識別。間接免疫熒光法不需要復雜、費時的化學制備程序，而酶聯(lián)免疫吸附測定等實驗，要取得高特異性則必須提取和純化抗原，并將其吸附于固相載體上，如果抗原不純，則相關抗體會出現(xiàn)假陽性結果。 間接免疫熒光法保留了原基質的完整抗原譜，因而可同時檢測大量抗體.獲得較高的檢測效率。當抗幾種不同抗原的抗體需要在一種生物基質上同時檢測時(如抗細胞核抗原抗體)，或為每一種實驗逐一準備抗原很困難或相當復雜時，就應該選擇免疫熒光法。另外，應用免疫熒光法還可檢測到一些至今未知的抗體。

  在沒有熒光顯微鏡時，可嘗試用酶標記的第二抗體代替熒光標記的抗體，但是檢測的質量會明顯下降。因為在免疫熒光法中，指示劑染色是通過抗體直接結合在細胞抗原上產(chǎn)生的，而免疫酶法，染色則是彌散地圍繞在抗原周圍的區(qū)域。因此免疫酶法并不總是像免疫熒光法那樣能區(qū)分抗原分布的細小差別。而且應用酶染色時，會導致許多自身抗體不能被區(qū)分或根本測不到。僅應用細胞核制備物免疫酶染色的純光度法評價也是不可取的，因為這不可避免地導致一些自身抗體被漏檢。

  實驗室工作者需要經(jīng)過一定的專業(yè)訓練并不斷實踐，方可勝任熒光顯微鏡下的讀片工作。顯微鏡下的結果判斷，為綜合知識的體現(xiàn)，到目前為止，尚沒有任何儀器可取代人工讀片。

  (一)實驗基質的選擇和血清的稀釋度

  1.實驗基質的選擇用間接免疫熒光法對自身抗體進行測定的效果，在很大程度上取決于基質的質量(包括基質本身的質量及制備的質量)。這些實驗基質，通常是用動物或人類的細胞或組織，經(jīng)一系列方法進行處理，如Hep-2細胞的培養(yǎng)、吸附和固定，玲凍組織切片的制備、貼片等。國內(nèi)不少實驗室仍在自制實驗基質，這已越來越不適應實驗標準化、規(guī)范化、現(xiàn)代化的需要，建議應盡可能選擇生產(chǎn)工藝、質控措施嚴格的商品化試劑盒，以保證實驗結果準確可靠。檢測不同的自身抗體應選擇不同來源的實驗基質(不同動物的不同組織)。

  2.血清的稀釋度 一般來講，一個待測標本，要測定某種或多種自身抗體，通常需要先測定一個起始稀釋度。如該稀釋度的檢測結果為陰性，則認為該抗體或多種抗體不顯著存在(無臨床價值)，通常無需稀釋標本做進一步檢測。如果該稀釋度的檢測結果為陽性，則認為該抗體明顯存在(可能有臨床意義)，可將標本做進一步稀釋，以獲得該抗體的滴度。因此確定待測標本合適的起始稀釋度，顯得十分重要。由于待測血清的起始稀釋度是結合臨床統(tǒng)計所得，而不同的實驗室采用的方法學有差異，故不同實驗室的血清起始稀釋度可能不同。另外，為了避免前帶現(xiàn)象的發(fā)生，有時對可疑的陰性標本，尚需進一步的稀釋后進行測定。

  (二)實驗操作的標準化滴定平板技術

  實驗標準化流程為滴加樣品、標記抗體至加樣板，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時，載片上的所有生物薄片均與液滴接觸，反應同時開始。因為液體被局限在一封閉的空間，不再需要傳統(tǒng)“濕盒"，可同時在一致的反應條件孵育大量的標本。下面以間接免疫熒光法為例，介紹滴定平板技術的操作過程：

  1.準備 檢查加樣板：觀察是否反應區(qū)親水而周邊疏水，如果不是，用濕紙巾擦干凈，隨后從試劑盒中取出載片，等平衡至室溫時方可打開包裝。注意不要觸摸生物薄片，用筆編號、標記。

  2.稀釋血清 根據(jù)使用者實驗設計，用PBS-Tween緩沖液稀釋血清，每次實驗均需陽性、陰性對照，使用前要混勻。

  3.加樣 按順序分別滴加25ul稀釋后血清至加樣板每一反應區(qū)，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后再開始溫育。

  4.步溫育 將載片貼有基質的一面朝下蓋在加樣板的凹糟里，反應即開始。室溫下溫育30分鐘。

  5.沖洗 用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗載片1秒鐘(注意水流不要太急，不要直接對著基質)，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯，浸洗至少1分鐘。

  6.加樣滴加20ul異硫氰酸熒光素標記的抗人球蛋白至一潔凈加樣板的反應區(qū)，加完方可繼續(xù)溫育。異硫氰酸熒光素標記抗人球蛋白使用前需混勻，用PBS-Tween緩沖液稀釋。

  7.第二步溫育從PBSTween緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦干背面和邊緣后，立即蓋在加樣板上，注意不要擦拭反應區(qū)。注意避免陽光直接照射載片，室溫溫育30分鐘。

  8.沖洗用燒杯盛PBS—Tween緩沖液流水沖載片1秒鐘(水流不要太急，不要直接對著基質)，然后立即將其浸入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少1分鐘。

  9.封片加甘油/PBS至蓋玻片，每一反應區(qū)約10ul。從pBS-Tween緩沖液取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區(qū)間鯨。將蓋玻片輕輕蓋在載片上。

  10.結果判斷 熒光顯微鏡下觀察熒光。

  (三)抗體檢測的質量控制及注意事項

  l.質量控制 自身抗體檢測的質量控制是用多種手段對自身抗體存在與否、濃度的多少進行控制和評價，有利于實驗室內(nèi)部、實驗室之間對同一標本獲取相同具有可比性的結果，是衡量實驗室檢測水平的一個重要指標。然而.自身抗體檢測的質量控制，并不是一件容易的工作。因為不同實驗室所用的抗原基質存在差異、抗原的固定方法有差異或不同，血清的稀釋方法不同以及操作者對不同熒光模式的識別能力不同等，均可影響到自身抗體的檢酒質量。實驗室在進行臨床檢測時，應同時檢測陽性對照、陰性對照，以監(jiān)測結果的準確性。國內(nèi)急需成立專門的學術機構，參照標準，與接軌，建立自己當?shù)氐臉藴?，開展自身抗體檢測的質量控制。

  2.實驗結果的進一步確認(兩級測定) 間接免疫熒光法，提供了對自身抗體進行篩選的理想途徑。許多情況下，僅使用該方法就可為臨床提供足夠的診斷信息，不需要做進一步的實驗。在自身抗體的檢測中，稱間接免疫熒光法為“水平1測定"。如果有必要對自身抗體進行進一步的單特異性區(qū)分，則可應用其他方法，如酶免疫測定法、對流免疫電泳及免疫雙擴散法等，稱這些實驗為“水平2測定。酶免疫測定法所用的抗原必須為純化的。許多抗原不易被純化，且很多自身抗體的確切抗原至今未知。故目前只有一小部分用HEp-2細胞柱測到的抗體及小部分組織抗體，進行進一步單特異性檢測。然而抗體的終區(qū)分，需要使用純化的抗原作為實驗基質。單獨的“水平2"測定，不能適應自身抗體檢測的需要。特別是對抗核抗體的測定，單做“水平2"測定將會漏掉某些自身抗體，故必須同時用免疫熒光法進行檢測。

  3.實驗報告及解釋

  (1)陰性：在整個檢測系統(tǒng)(包括各種質控)正常的情況下，當待檢標本在合適的起始稀釋度下，實驗基質沒有明顯的熒光染色，或沒有可辨認的熒光模型時，稱此待檢的血清樣本的某種自身抗體陰性。

  (2)陽性：整個檢測系統(tǒng)(包括各種質控)正常的情況下，當血清待檢標本在合適的起始稀釋度下，產(chǎn)生明顯高于陰性對照的特異熒光，且有明鮮可以辨認的熒光模式，稱此待檢血清標本的某待檢抗體陽性。

  注意，有時申請報告中，申請檢測的自身抗體結果為陰性，而發(fā)現(xiàn)其他自身抗體為陽性。在這種情況下，如果該檢測到的自身抗體有明顯的臨床意義，則要報告此結果。如該自身抗體無明確臨床意義，則可不報告，以避免造成混亂。但如果臨床醫(yī)生與實驗室工作者進行研究合作，則可報告或另外進行交流。

  (3)免疫熒光模式;對陽性結果應報告其熒光模式，以初步提供自身抗體針對的靶抗原特異性，為進一步進行“水平2"檢測提供信息。

  (4)滴度：滴度的定義為：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清比較，能觀測到的特異性的熒光反應的高稀釋度。檢測結果應該報告滴度，為臨床提供動態(tài)的信息，因為自身抗體陽性患者，在診斷和治療過程中，要做多次檢測，且有些自身抗體的滴度與病情密切相關。

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