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公司名稱:上海古朵生物科技有限公司

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電話:18321664727

手機(jī):13621980056

郵件:2712232205@qq.com

地址:上海市嘉定區(qū)曹安公路5588號

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細(xì)胞爬片、冰凍切片、骨組織 TSA多色免疫熒光方法大全

發(fā)布時間:2023-08-15瀏覽次數(shù):909返回列表

  細(xì)胞爬片、冰凍切片、骨組織 TSA多色免疫熒光方法大全


  原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA,Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法,類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法 ,TSA技術(shù)同樣采用HRP標(biāo)記的二抗,同樣有對應(yīng)的“顯色”步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物,產(chǎn)生活化熒光底物,活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結(jié)合,使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP復(fù)合物,重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育,換另一種酪胺熒光素底物,如此往復(fù)就可實現(xiàn)多重標(biāo)記。

  TSA詳細(xì)原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點(diǎn)),產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物,該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合,這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積,結(jié)果使其檢測信號得到10-100倍增強(qiáng)。簡單來說,用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素),來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián),使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理,前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉,共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育,周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束,熒光素都結(jié)合好后,后去檢測結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育,因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng),以及一抗二抗種屬匹配問題,大大減少了實驗設(shè)計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說,如果用TSA技術(shù),同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實驗,而且信號放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種:TYR-480,TYR-520,TYR-570,TYR-620,TYR-690,TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用。可以實現(xiàn)單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能,極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

  試劑盒規(guī)格:100T

  試劑盒組成:

  名稱規(guī)格保存條件

  TYR-520熒光染料(綠光)即用型,5mL-20℃

  TYR-570熒光染料(紅光)即用型,5mL-20℃

  TSA+增強(qiáng)劑(可選)濃縮型,50μl-20℃

  抗體洗脫液即用型,30mLRT

  HRP-山羊抗兔二抗即用型,10mL4℃

  備注:TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 在-20度下 ,均為固體,使用之前需解凍,抗體洗脫液使用前37度預(yù)熱至完全溶解。

  TSA+增強(qiáng)劑使用方法:TSA+增強(qiáng)劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號放大液的放大信號5-10倍,TSA+增強(qiáng)劑:TYR熒光放大液=1:500,使用TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項,可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

  操作流程:

  1、 冰凍切片準(zhǔn)備:冰箱取出冰凍切片恢復(fù)至室溫晾干水分后固定10-30min,PBS洗5min重復(fù)3次。

  2、 切片破膜:滴加破膜液通透20min,PBS洗5min重復(fù)3次。

  3、 抗原修復(fù):切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH9.0)的修復(fù)盒中60度水浴30min,自然冷卻,PBS洗5min重復(fù)3次(此步驟可選做,修復(fù)有助于抗原修復(fù)和去除內(nèi)源性過氧化物酶)。

  4、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:切片放入3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育25 min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。

  5、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內(nèi)滴加用3% BSA(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織,室溫封閉30min。

  6、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

  7、 加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。

  8、 熒光染料反應(yīng):TYRXXX熒光染料反應(yīng)2-15min,PBS洗三次。

  9、 上一輪抗體洗脫:滴加適量37度預(yù)熱至完全溶解的抗體洗脫液覆蓋樣本,37度放置5-20分鐘,棄去洗脫液,再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本37度放置5-20分鐘,棄洗脫液,PBS洗三次,每次5分鐘。

  10、 重復(fù)2-9步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

  11、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。

  12、 封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

  13、 鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

  染料激發(fā)波長發(fā)射波長

  DAPI 藍(lán)色350420

  TYR-480450480

  TYR-520綠色490520

  TYR-570紅色550570

  TYR-620590620

  TYR-690630690

  TYR-780750780

  文章引用試劑盒/方法:Co-staining of A and B was performed using a Three-color Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

  細(xì)胞爬片 冰凍切片 骨組織 TSA多色免疫熒光上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品,勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個國家和地區(qū),我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向,不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品,提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。

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