冰凍切片多重免疫熒光試劑盒(雙標(biāo)三色)

  原理介紹: 酪酰胺信號(hào)放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過(guò)氧化酶(HRP)對(duì)靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法 ，TSA技術(shù)同樣采用HRP標(biāo)記的二抗，同樣有對(duì)應(yīng)的“顯色”步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價(jià)結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價(jià)結(jié)合的一抗-二抗-HRP復(fù)合物，重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來(lái)第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。

  TSA詳細(xì)原理是利用酪胺Tyramide的過(guò)氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到10-100倍增強(qiáng)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理，前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，后去檢測(cè)結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無(wú)需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問(wèn)題，大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說(shuō)，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。本公司開(kāi)發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用?？梢詫?shí)現(xiàn)單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

  試劑盒規(guī)格：100T

  試劑盒組成：

  名稱規(guī)格保存條件

  TYR-520熒光染料(綠光)即用型，5mL-20℃

  TYR-570熒光染料(紅光)即用型，5mL-20℃

  TSA+增強(qiáng)劑(可選)濃縮型，50μl-20℃

  抗體洗脫液即用型，30mLRT

  HRP-山羊抗兔二抗即用型，10mL4℃

  備注：TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 在-20度下 ，均為固體，使用之前需解凍，抗體洗脫液使用前37度預(yù)熱至完全溶解。

  TSA+增強(qiáng)劑使用方法：TSA+增強(qiáng)劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)放大液的放大信號(hào)5-10倍，TSA+增強(qiáng)劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項(xiàng)，可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

  操作流程：

  1、 冰凍切片準(zhǔn)備：冰箱取出冰凍切片恢復(fù)至室溫晾干水分后固定10-30min，PBS洗5min重復(fù)3次。

  2、 切片破膜：滴加破膜液通透20min，PBS洗5min重復(fù)3次。

  3、 抗原修復(fù)：切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH9.0)的修復(fù)盒中60度水浴30min，自然冷卻，PBS洗5min重復(fù)3次(此步驟可選做，修復(fù)有助于抗原修復(fù)和去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶)。

  4、 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

  5、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用3% BSA(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

  6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

  7、 加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

  8、 熒光染料反應(yīng)：TYRXXX熒光染料反應(yīng) 2-15min，PBS洗三次。

  9、 上一輪抗體洗脫：滴加適量37度預(yù)熱至完全溶解的抗體洗脫液覆蓋樣本，37度放置5-10分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本37度放置5-10分鐘，棄洗脫液，PBS洗三次，每次5分鐘(務(wù)必確保洗滌充分)。

  10、 重復(fù)2-9步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

  11、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

  12、 封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

  13、 鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

  染料激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)

  DAPI 藍(lán)色350420

  TYR-480450480

  TYR-520綠色490520

  TYR-570紅色550570

  TYR-620590620

  TYR-690630690

  TYR-780750780

  文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Three-color Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

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