血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用及如何正確使用血清

  血清，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白已被除去的血漿。血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。氨基酸有多種，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有些氨基酸動(dòng)物細(xì)胞本身不能合成(稱為必需氨基酸)，必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長(zhǎng)激素等及多種生長(zhǎng)因子(如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子等);血清還含有多種未知的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和貼附。因此，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證細(xì)胞能夠順利生長(zhǎng)和增殖，一般需添加10%～20%的血清，動(dòng)物血清還可起到酸堿度緩沖液的作用。

  常用血清種類

  目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用兔血清、馬血清等。

  選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來(lái)源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對(duì)其有比較深入的理解。

  牛血清對(duì)絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細(xì)胞時(shí)使用兔血清、馬血清等其他血清。牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。

  牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)高的，因?yàn)樘ヅ＿€未接觸外界，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分少。

  常見(jiàn)血清及規(guī)格

  胎牛血清：(八月齡胎牛心臟穿刺取血)

  適用于細(xì)胞株保藏及嬌貴細(xì)胞培養(yǎng)。

  超級(jí)新生牛血清：(出生12～24小時(shí)新生牛靜脈采血，采血后靜置自然析出的血清)

  適用于淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、二倍體細(xì)胞等基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究。

  標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清：(出生12～24小時(shí)新生牛靜脈采血，經(jīng)離心分離的血清)

  BVDV 抗原抗體均陰性，適用于原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)和人用疫苗(vaccine)生產(chǎn)和研制。特別適用于豬瘟疫苗(vaccine)的研制、生產(chǎn)。

  普通新生牛血清：(出生12～24小時(shí)新生牛靜脈采血，融血或微融血的血清)

  適用于普通原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)和獸用疫苗(vaccine)及診斷試劑生產(chǎn)

  小牛血清：(出生三月齡小牛動(dòng)脈采血分離血清)

  適用于生物醫(yī)學(xué)研究等。

  大牛血清： 適用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白液、膽固醇液及牛血清白蛋白制備等。

  馬血清： 適用于獸用疫苗(vaccine)生產(chǎn)和診斷試劑生產(chǎn)。

  山羊血清：適用于生物醫(yī)學(xué)研究基礎(chǔ)等。

  血清質(zhì)量的差異性大如何選擇

  市場(chǎng)上各種血清產(chǎn)品魚龍混珠，一不小心，你可能就使用了品質(zhì)不好的血清。

  血清按照采血時(shí)間可分為胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，三者的優(yōu)劣順序?yàn)椋禾ヅＱ?gt;新生牛血清>小牛血清。

  一般細(xì)胞建議使用胎牛血清培養(yǎng)，部分細(xì)胞可使用新生牛血清培養(yǎng)，小牛血清則不建議用于細(xì)胞培養(yǎng)。

  血清在生產(chǎn)中受采血來(lái)源，條件和生產(chǎn)工藝等的影響，質(zhì)量差異較大，即使相同廠家不同批次的血清都會(huì)有差異;另外不同種類的細(xì)胞對(duì)血清的適應(yīng)也有不同，這可能與血清中所含的生長(zhǎng)因子有關(guān)，所以血清在使用之前應(yīng)提前驗(yàn)證一下對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。

  培養(yǎng)細(xì)胞用的培養(yǎng)基為人工合成，但動(dòng)物細(xì)胞生活的內(nèi)環(huán)境還有一些成分尚未研究清楚，加入動(dòng)物血清是為了給體外培養(yǎng)的細(xì)胞提供一個(gè)類似生物體內(nèi)的環(huán)境，此外動(dòng)物血清中也包含了一些動(dòng)物的激素和酶，可以促進(jìn)細(xì)胞的發(fā)育主要作用有

  a、提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或合成培養(yǎng)基所缺乏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：如氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等;

  b、提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的激素、生長(zhǎng)因子;

  c、提供貼壁細(xì)胞所需的貼壁因子和擴(kuò)展因子;

  d、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，使細(xì)胞免受蛋白酶的損傷;

  e、血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用;

  f、血清中的結(jié)合蛋白還可消除某些毒素和金屬對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

  細(xì)胞培養(yǎng)中如何正確使用和保存血清

  保存：胎牛血清一般在-20℃以下冷凍保存，使用之前應(yīng)先放到2~8℃冰箱過(guò)夜溶解，不建議直接放到室溫或37℃水浴溶解(升溫過(guò)快會(huì)導(dǎo)致血清中蛋白質(zhì)大量沉淀，影響血清質(zhì)量);若一次使用量不多，可溶解后分裝至小包裝凍存，避免反復(fù)凍融。血清解凍后在2~8℃保存時(shí)間一般不超過(guò)一個(gè)月。

  滅活：一般血清使用時(shí)不需要滅活。滅活的作用是消除血清中的各種補(bǔ)體成分，但事實(shí)證明血清滅活之后會(huì)產(chǎn)生大量的沉淀，會(huì)對(duì)血清的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)造成較大破壞，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)不利。

  沉淀：血清中的沉淀一般為析出的纖維蛋白，另外新生牛血清中各種蛋白含量明顯偏高，溶解時(shí)較易產(chǎn)生大量沉淀。血清中出現(xiàn)沉淀一般不會(huì)影響血清質(zhì)量，并且升溫至37℃時(shí)會(huì)溶解(不建議加熱血清);若沉淀量較多，可在400×g離心3min，取上清使用。血清和添加了血清的培養(yǎng)基在使用時(shí)不需要過(guò)濾。

  血清使用中可能遇到問(wèn)題

  a、如何換使用血清

  需要換使用不同品牌或批次的血清之前，需提前對(duì)要使用的血清進(jìn)行驗(yàn)證，可使用自己經(jīng)常培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行，保證該血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。在換使用時(shí)可以將要換的血清和原本使用的血清1:1混合使用1~2代，待細(xì)胞完全適應(yīng)后進(jìn)行換。

  b、血清顏色的問(wèn)題

  血清顏色主要是黃色或紅色，一般淡黃色或微紅色為正常。這個(gè)主要受血紅蛋白含量的影響，若顏色太深(接近培養(yǎng)基的顏色)，則有可能是采血過(guò)程中出現(xiàn)溶血導(dǎo)致的。

  c、血清沉淀的問(wèn)題

  血清中的沉淀主要是纖維蛋白凝集產(chǎn)生的，一般來(lái)說(shuō)每次凍融都會(huì)產(chǎn)生一部分的沉淀，但不影響血清質(zhì)量和使用。另外，血清在加入到培養(yǎng)基中后也是有可能會(huì)產(chǎn)生沉淀的，特別是滅活后的血清，會(huì)持續(xù)產(chǎn)生黑色顆粒，這可能會(huì)被錯(cuò)誤判斷為污染。一般血清產(chǎn)生的沉淀在顯微鏡下觀察為微小的不規(guī)則絮狀或者顆粒物質(zhì)，排查是否為污染好的辦法是用瓊脂板檢測(cè)。

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