免疫ELISA試劑盒檢測法注意事項(xiàng)

  目前考察ELISA試劑盒免疫法檢測試劑盒種類繁多，在實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)，一般在試劑盒說明書中列出以下指標(biāo)：檢測限;回收率;交叉反應(yīng)率;標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜及數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線至少由5個濃度組成;IC50測定值及變形曲線點(diǎn)數(shù)目的是比較規(guī)范的試劑盒，可以選擇。

  1.臨界值(cut-off)的確定

  在實(shí)際使用免疫法檢測時要首先確定臨界值。通過檢測結(jié)果與臨界值的比較，可判定樣品為陰性或可疑。對于禁用藥物，檢測方法的臨界值為定量限，即現(xiàn)有的公認(rèn)的儀器檢測所能達(dá)到的定量限。對于有殘留限量(MRL)的藥物，檢測方法的臨界值為20份添加MRL濃度的樣品重復(fù)3次測定的均值減去1.64倍標(biāo)準(zhǔn)差。檢測結(jié)果如小于臨界值為陰性，大于或等于臨界值或標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為可疑，需要用確證法確證。

  2.檢測限的測定可添加MRL和MRL上下各一個濃度。

  每個試驗(yàn)室在使用免疫法檢測時，應(yīng)做一下各自試驗(yàn)室的檢測限。檢測限為20份空白樣品測定的均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差。如果經(jīng)規(guī)范操作后所得檢測限大于臨界值時，說明試劑盒背景干擾大，試劑盒靈敏度不能滿足檢測要求，應(yīng)與試劑盒廠家聯(lián)系或棄去不用選用另外的試劑盒。

  3.免疫檢測方法驗(yàn)證

  在使用免疫法檢測樣品時，應(yīng)對方法進(jìn)行驗(yàn)證。主要測定以下內(nèi)容：

  ①標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線至少由5個濃度組成，測定次數(shù)不少于5次，以確定工作濃度范圍和IC50范圍。一般臨界值為IC50附近，檢測靈敏度高。

  ②樣品檢測限的測定。

  ③樣品添加回收實(shí)驗(yàn)。對禁用藥物可添加定量限和2倍定量限，對于有殘留限量(MRL)的藥物，可添加MRL和MRL上下各一個濃度。

  準(zhǔn)確度：若回收率大于40%符合相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求。度：批內(nèi)變異系數(shù)每批平行樣之間的變異系數(shù)小于或等于25%，對于禁用藥物小于或等于30%。批間變異系數(shù)所有樣品間變異系數(shù)小于或等于30%，對于禁用藥物小于或等于40%。滿足以上準(zhǔn)確度和度要求，說明免疫方法可行，可用來檢測藥物殘留。

  4.其他

  ①對于可用于多殘留檢測的ELISA試劑盒，以交叉反應(yīng)率低的藥物做陽性添加測定臨界值(cut-off)。

  ②實(shí)際檢測樣品時要包括以下實(shí)驗(yàn)：至少做兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩個陰性對照品，兩個添加臨界值(cut-off)的陽性對照品，兩個平行的待檢樣品。檢測結(jié)果出來后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線形狀(符合檢測要求為S形)，IC50與臨界值是否相近及陽性樣品回收率，樣品平行情況可確定檢測是否可信。

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