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公司名稱:上海古朵生物科技有限公司

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地址:上海市嘉定區(qū)曹安公路5588號(hào)

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知識(shí)分享:IHC(P) 免疫組化石蠟切片操作規(guī)程

發(fā)布時(shí)間:2023-11-09瀏覽次數(shù):766返回列表

  IHC(P) 免疫組化石蠟切片操作規(guī)程

  (一)、儀器設(shè)備

  1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐;

  2)水浴鍋

  (二)、試劑

  1)PBS緩沖液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。

  2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g。

  3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA?2H2O,用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。

  4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。

  5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。

  6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

  7)封裱劑:

  a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0~9.5)等量混合;

  b、油和TBS(或PBS)配制。

  8)TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標(biāo)本;pH7.0~7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。

  (三)、操作流程

  1、脫蠟和水化

  脫蠟前,應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

  1)組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,換二甲苯后再浸泡10分鐘;

  2)無(wú)水乙醇中浸泡5分鐘;

  3)95%乙醇中浸泡5分鐘;

  4)70%乙醇中浸泡5分鐘;

  2、抗原修復(fù)

  用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

  1)抗原熱修復(fù)

  (1)高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子,但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會(huì)升起來(lái)。10分鐘后,去除熱源,置入涼水中,當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。

  (2)煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10~15分鐘。

  (3)微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5~10分鐘,反復(fù)1-2次。適用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

  2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃,切片也預(yù)熱至37℃,消化時(shí)間約為5~30分鐘;胃蛋白酶消化37℃時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。

  抗原修復(fù)注意事項(xiàng):

  1)載玻片的處理:

  抗原修復(fù)過(guò)程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行,可選用PES、Poly-L-Lysine等試劑,對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下:

  1.1 APES:現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中,停留20~30秒鐘,取出稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES,置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位,并盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結(jié)果。

  1.2 Poly-L-Lysine:將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡5分鐘,60oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過(guò)夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。

  2)常用酶消化:

  2.1 胰蛋白酶:一般使用濃度為0.05%~0.1%,消化時(shí)間為37℃、10~40分鐘,主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。

  2.2 胃蛋白酶:一般使用濃度為0.4%,消化時(shí)間為37℃、30~180分鐘,主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示,如:Laminin(層粘蛋白),Collagen IV(IV型膠原)等。

  2.3 皂素(Saponin):一般使用濃度為2~10?g/ml的saponin溶液,消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。

  3)抗原熱修復(fù):

  可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件,選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)。抗原熱修復(fù)可選用各種緩沖液,如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等,但實(shí)驗(yàn)證明,以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)效果。請(qǐng)選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制,取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中,混勻,其pH值在6.0 ± 0.1,如因蒸餾水本身造成的pH值偏差,請(qǐng)自行調(diào)整。

  3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,3%H2O2處理10分鐘,蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘(注意:無(wú)論是使用醫(yī)用或家用微波爐,請(qǐng)根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件,務(wù)必滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求)。取出容器,室溫冷卻10~20分鐘(注意:不可將切片從緩沖液中取出冷卻,以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型)。PBS洗,下接免疫組化染色步驟。

  3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,放入鍋內(nèi),使切片位于液面以下,蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)(約加熱5~6分鐘后),計(jì)時(shí)1~2分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗后,PBS洗2分鐘×3,下接免疫組化染色步驟。

  3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來(lái)水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計(jì)時(shí)15~20分鐘,然后端離電爐,室溫冷卻20~30分鐘,蒸餾水沖洗,PBS洗,下接免疫組化染色步驟。

  3、免疫組織化學(xué)染色

  SP法

  1)脫蠟、水化;

  2)PBS洗2~3次各5分鐘;

  3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室溫靜置10分鐘;

  4)PBS洗2~3次各5分鐘;

  5)抗原修復(fù);

  6)PBS洗2~3次各5分鐘;

  7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

  8)滴加Ⅰ抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或者4℃過(guò)夜或者37℃1小時(shí)。

  9)4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。

  10)PBS洗3次各5分鐘;

  11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置,或37℃1小時(shí);

  12)II抗中可加入0.05%的tween-20。

  13)PBS洗3次各5分鐘;

  14)DAB顯色5~10分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度;

  15)PBS或自來(lái)水沖洗10分鐘;

  16)蘇木精復(fù)染2分鐘,鹽酸酒精分化;

  17)自來(lái)水沖洗10~15分鐘;

  18)脫水、透明、封片、鏡檢。

  SABC法

  1)脫蠟、水化。

  2)PBS洗兩次各5分鐘。

  3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,蒸餾水洗3次。

  4)抗原修復(fù)。

  5)PBS洗5分鐘。

  6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

  7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時(shí)或者4℃過(guò)夜或者37℃1小時(shí)(4℃過(guò)夜后在37℃復(fù)溫45分鐘)。

  8)PBS洗三次每次2分鐘。

  9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分鐘。

  10)PBC洗3次每次2分鐘。

  11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘。

  12)PBS洗4次每次5分鐘。

  13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。

  14)蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。

  15)脫水、透明、封片、鏡檢。

  ELISA 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品,勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū),我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向,不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品,提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒

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