古朵帶您了解哪些指標(biāo)評估來判斷ELISA試劑盒的質(zhì)量呢

  01  特異性

  特異性簡單來說就是陰性樣本的陰性檢出率，要保證這一點首先就需要做到與其他檢測抗體(原)無交叉感染，并且保證陰性樣本檢出的準(zhǔn)確性。

  02  靈敏度

  靈敏度簡單來說就是陽性樣本的陽性檢出率，一方面能夠反映出試劑盒對于被檢物質(zhì)的低檢測能力，另一方面需要保證陽性樣本檢出的準(zhǔn)確性。可通過我們自身待檢物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行選擇，如果我們待檢物質(zhì)濃度量很低，可以選擇高靈敏的試劑。

  03  性

  又可稱作重復(fù)性，一般而言，對于ELISA試劑盒而言，板間及板內(nèi)性可控制在15%以內(nèi)。有些ELISA試劑盒性可達(dá)到10%以內(nèi)。

  04  穩(wěn)定性

  穩(wěn)定性是試劑盒必須有的基本屬性，是指試劑(盒)在有效期內(nèi)和規(guī)定條件下保持其性能的能力，一般有效期穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、以及凍融穩(wěn)定性。

  05  操作簡便性

  同樣對于ELISA的操作簡便程度大家也是非常關(guān)心的，操作時間以及操作步驟也是我們在選擇試劑盒過程中需要考慮的問題。

  二、取材方法及注意事項

  a、液體樣本 液體樣本處理原則：所有的液體樣本，用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，如果以后遇到其他的液體樣本，也按這個方法，納入?yún)R總表。

  1、血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

  2、血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

  3、尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  4、胸腹水：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  5、腦脊液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  6、唾液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  7、細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  8、牛奶：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  9、蜂蜜：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。10、全血：用含有抗凝劑的無菌管收集，立即輕輕搖動，來回輕輕顛倒數(shù)次，使血液和抗凝劑混勻，以防血液凝固。

  b、固體樣本 固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測，細(xì)胞內(nèi)的蛋白，要先收集細(xì)胞，再用合適方法破碎，離心取上清測試。

  1、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對于植物組織，不好勻漿的話，就在液氮中充分研磨;

  2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本許多待測蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個時候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。(1)培養(yǎng)的細(xì)胞A、動物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融(如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎)，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。B、植物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。(2)組織的細(xì)胞切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。

  3、土壤：稱取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標(biāo)本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

  4、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

  5. 植物標(biāo)本的精采集及保存1、稱取0.1g(誤差±3%以內(nèi))新鮮植物組織樣本，在液氮中充分研磨;2、加入1ml的提取液(80%甲醇),置于-20度過夜;3、于4度，8000rpm，離心1小時，取上清;4、上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇(1ml)平衡柱上樣收集樣品移開樣品后用甲醇(5ml)洗柱(5ml)洗柱甲醇(5ml)洗柱循環(huán)。過柱后的樣本真空干燥或氮氣吹干，保存?zhèn)溆?5、上樣前加入pH7.4PBS緩沖液(1ml定容)。混勻后室溫放置30分鐘，然后4度離心(8000rpm，15分鐘)，取上清并暫時保存于4度待用。

  c.植物標(biāo)本中相關(guān)酶或蛋白的測定：(粗提取)

  1、新鮮植物組織請在液氮中充分研磨;

  2、加入樣品體積9倍的提取液(pH7.4PBS緩沖液);

  3、請于4度，8000rpm，離心30分鐘，取上清并暫時保存于4度待用。

  三、樣本收集注意事項

  1、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。2、標(biāo)本采集后盡快進(jìn)行實驗，若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

  3、我們羅列的是通用的樣本處理方法，無法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本，建議實驗人員多參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，自行設(shè)計合理的樣本處理方法。

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