你知道如何驗(yàn)證層析填料的壽命嗎？浩瀚色譜儀器為您奉上層析填料的壽命驗(yàn)證全攻略，希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?br /> 1.重復(fù)裝柱：
每次裝柱的過程都涉及到填料的脫氣處理，及裝填柱床時(shí)的壓縮柱床，然后脫氣時(shí)的超聲或者抽濾都會對填料施壓，壓縮柱床也要對填料施壓，反復(fù)的施壓及壓力控制不當(dāng)也會使填料的物理性能發(fā)生變化從而影響填料的壽命。
每次裝柱的過程都涉及到填料的脫氣處理，及裝填柱床時(shí)的壓縮柱床，然后脫氣時(shí)的超聲或者抽濾都會對填料施壓，壓縮柱床也要對填料施壓，反復(fù)的施壓及壓力控制不當(dāng)也會使填料的物理性能發(fā)生變化從而影響填料的壽命。
柱床被嚴(yán)重污染或者進(jìn)氣泡時(shí)，拆裝清洗比CIP效果好，有利于填料壽命衰減的降低。
2.樣品狀態(tài)：
a.樣品澄清度：樣品越澄清對填料的壽命衰減影響越小。
b.樣品粘度：樣品的粘度越小，對填料壽命的影響越小。
c.樣品酸堿度：過酸過堿都會加速填料壽命的衰減。
d.樣品離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高填料壽命衰減的越快。
e.樣品成分組成：樣品成分越復(fù)雜，層析過程越復(fù)雜，填料的壽命衰減越快（這也與填料所處的工藝階段吻合，捕獲粗純階段填料壽命衰減的快，精純階段填料壽命衰減的慢。）
3.層析工藝
a.柱床高度，流速及反壓越大，工藝過程填料受到的外力就會增大，填料的壽命衰減就會增大。
b.層析工藝過程的緩沖液的種類及洗脫的CV數(shù)也會影響填料的壽命，緩沖液越溫和對填料壽命衰減影響越小，洗脫CV數(shù)越小對填料壽命衰減影響越小。
4.維護(hù)保養(yǎng)
合理的維護(hù)保養(yǎng)過程可以降低填料壽命的衰減，但是維護(hù)過程的CIP及消毒過程通常都需要劇烈的條件，如強(qiáng)酸強(qiáng)堿等，所以CIP的強(qiáng)度及頻率越大對填料的壽命衰減影響越大。
a.再生：恢復(fù)介質(zhì)原有功能
b.清洗（CIP)：去除填料中積累的雜質(zhì)及污染物，比再生劇烈
c.消毒：去內(nèi)毒素及微生物
d.保存：使用后合理保存（溫度，保存液）
有效降低層析填料壽命的衰減
上面介紹了填料壽命衰減的影響因素，針對這些因素我們可以通過一些方式有效降低其對壽命衰減過程的影響。
1填料的認(rèn)知
在層析工藝之前我們要對層析的耐壓性，化學(xué)穩(wěn)定性（如化學(xué)耐受性），物理穩(wěn)定性（如壓縮因子），保存條件，分離原理，材質(zhì)做足夠的認(rèn)識，避免不合適的層析過程影響填料的壽命衰減（如IDA-Ni應(yīng)避免接觸氧化劑還原劑和螯合劑)。
2樣品的認(rèn)知
在層析工藝的時(shí)候我們要對我們的樣品做足夠的認(rèn)知，包括樣品的濃度，樣品的組成等做一定的了解（如上游工藝，如真核細(xì)胞分泌表達(dá)的樣品，要了解其上游工藝，培養(yǎng)基組成，培養(yǎng)過程等的一些添加劑是否對填料的性能及壽命衰減會有影響）。
3樣品的前處理
a.樣品中的顆粒物質(zhì)在層析前要進(jìn)行澄清處理，澄清處理的越徹底，對填料壽命衰減影響越小。
b.樣品的粘度要盡量小。
c.樣品的組份應(yīng)滿足層析工藝且對填料的性能沒有影響，必要時(shí)可以用匯研生物的脫鹽柱Focudex G-25柱對樣品進(jìn)行換液處理。
4層析工藝
a.優(yōu)化柱床高度使其既滿足工藝指標(biāo)，又可減少反壓
b.優(yōu)化層析緩沖液使其對填料壽命衰減的影響zui?。ū热缦疵搹?qiáng)度的合理溫和可以降低配基的脫落和基質(zhì)的老化）。
c.優(yōu)化層析過程減少非特異性吸附等也可以有效降低填料壽命的衰減過程。
5維護(hù)保養(yǎng)
不同的介質(zhì)及不同的污染物清洗方法不同，清洗紀(jì)要清洗效果同時(shí)要減少對層析介質(zhì)的損傷，還要避免清洗試劑對介質(zhì)的二次污染，選擇合適的清洗方法非常重要。依據(jù)層析介質(zhì)的污染物的種類進(jìn)行清洗方法，下面分別介紹不同污染物清洗方法的選擇。
   清洗是去除再生沒有去除的污染物，那么我們就要了解污染物的來源，污染物與物料及工藝階段，工藝過程聯(lián)系緊密。
1）捕獲階段，物料通常比較復(fù)雜，含有大量的雜質(zhì)，色素，內(nèi)素素等，再生往往難以去除干凈，那么待清洗去除的物質(zhì)也很復(fù)雜，清洗過程也很復(fù)雜，可能需要多種模式配合作用，同時(shí)清洗的頻率和強(qiáng)度都要高。通常使用1個循環(huán)后就要清洗一次。
2）中度純化階段，物料已經(jīng)去除了大部分雜質(zhì)，通過再生殘留在介質(zhì)上的污染物就很少了，清洗過程和頻率比捕獲階段就要低很多。使用5-10個循環(huán)后就需要清洗一次。
3）精純階段，物料已很純凈，只含有微量的雜質(zhì)，再生通常就可以達(dá)到清洗的目的，此時(shí)清洗的頻率和強(qiáng)度就低。根據(jù)小試確定的清洗需要開始的狀態(tài)進(jìn)行清洗。
a可溶性雜蛋白的清洗
可溶雜蛋白主要是HCP，可溶性雜蛋白主要是由介質(zhì)的非特異性吸附或者洗脫強(qiáng)度過低引起的，這個在我們再生的時(shí)候通常已經(jīng)去除干凈，若介質(zhì)被可溶性雜蛋白污染，再生和清洗的過程往往可以合并為一步。
1）離子交換介質(zhì)用2M的氯化鈉洗1-2CV，接觸時(shí)間控制在15-30min，若清洗完保存，則需要用10mM氫氧化鈉或者20%的乙醇流經(jīng)柱床即可。
2）疏水層析被可溶性蛋白污染時(shí)，可用低濃度緩沖或者超純水，或者30%的異丙醇清洗2-3CV即可，
3）凝膠過濾介質(zhì)被可溶性雜蛋白污染時(shí)，可用2M的氯化鈉或者0.1-0.5M的氫氧化鈉清洗1CV即可。
4）親和層析被可溶性蛋白污染時(shí)，清洗要一句親和層析的類型進(jìn)行選擇。
層析介質(zhì)被可溶性蛋白污染時(shí)清洗過程可和再生過程合二為一同時(shí)進(jìn)行。
b固化的蛋白（沉淀或聚集）的清洗
固化在介質(zhì)中的蛋白，是介質(zhì)在使用的過程中，蛋白變性后沉淀在介質(zhì)，也有可能是介質(zhì)使用時(shí)介質(zhì)中高密度蛋白聚集而成沉淀（這與物料的性質(zhì)有關(guān)）。固化在介質(zhì)中的蛋白嚴(yán)重影響介質(zhì)的性能，要及時(shí)清洗。
1）凝膠過濾介質(zhì)，疏水介質(zhì)，離子交換介質(zhì)通常都可以通過0.5-1M的氫氧化鈉進(jìn)行清洗1-2CV即可，清洗完后要立即用水清洗到中性。
2）親和介質(zhì)的種類多，親和介質(zhì)被沉淀的蛋白污染時(shí)要依據(jù)親和介質(zhì)的種類及耐受性選擇合適的清洗方法，部分可通過尿素或等蛋白變性劑清洗1-2CV.
c疏水性蛋白的清洗
疏水性蛋白污染介質(zhì)時(shí)，離子交換介質(zhì)，疏水介質(zhì)，凝膠過濾介質(zhì)用3-4M的氫氧化鈉清洗3-4CV，然后立即用水洗到中性。親和層析介質(zhì)則要根據(jù)其種類選擇合適的方法清洗。
d脂類物質(zhì)的清洗
用0.5%的Triton X-100等非離子型去污劑清洗3-4CV,或者30%異丙醇及70%乙醇清洗3-4CV.
e核酸的清洗
用1M氯化鈉加1M氫氧化鈉清洗1-2CV,親和層析介質(zhì)需要摸索清洗方法。
f色素的清洗
色素是一類物質(zhì)，不同來源的色素的清洗過程差異較大，可根據(jù)介質(zhì)的性質(zhì)及色素的性質(zhì)進(jìn)行清洗，堿洗，酸洗，有機(jī)溶劑，及去污劑，變性劑都可以嘗試。
g內(nèi)毒素及微生物的清洗
內(nèi)素素及微生物的清洗通常用0.5-1M的氫氧化鈉清洗1-2CV之后，在用超純水沖洗中性。親和層析介質(zhì)可通過0.5%的非離子型去污劑及有機(jī)溶劑的方式清洗內(nèi)毒素。
清洗過程注意事項(xiàng)：
1）清洗過程要綜合考慮污染物的類型及介質(zhì)的種類，清洗的同時(shí)要減少對介質(zhì)的損傷。
2）清洗時(shí)通常需要多種方法組合使用，清洗過程并非是固定不變的。
3）清洗試劑應(yīng)選擇純度高的試劑，避免二次污染。
4）清洗之后要立即洗到中性保存。
5）清洗狀態(tài)的確定及方法的確定要結(jié)合整個工藝過程。
6）清洗之后要對清洗過程進(jìn)行驗(yàn)證，清洗目的實(shí)現(xiàn)，可通過測定載量，流速等介質(zhì)的性能指標(biāo)驗(yàn)證
6層析設(shè)備的選擇
層析柱的分布器，清洗死角，密封性，材質(zhì)也會影響層析填料的壽命。
層析填料壽命的界定
層析填料壽命的界定通常指在特定工藝條件下使用過程中，從開始使用到使用時(shí)與設(shè)定的工藝指標(biāo)發(fā)生偏差的使用次數(shù)。
工藝指標(biāo):
-目標(biāo)產(chǎn)品：純度，收率
-雜質(zhì)性質(zhì)：含量，種類
-層析過程：色譜曲線，載量，反壓等
填料性能：
-壓力
-流速
-載量
-再生后性能恢復(fù)
-清洗后性能恢復(fù)
層析填料壽命驗(yàn)證
壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)必須能夠完全反映商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的性能，壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)必要體現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模之間的相關(guān)性。
壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)必須能夠完全反映商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的性能，壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)必要體現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模之間的相關(guān)性。
1.壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)需和工業(yè)生產(chǎn)一致的因素
a.柱床高度
b.線性流速
c.填料型號
d.樣品在柱床中的保留時(shí)間
e.樣品的狀態(tài)及屬性（濃度，組成，前處理工藝）
f.層析過程（平衡，上樣，清洗，洗脫CV數(shù)及緩沖液種類）
g.清洗試劑的種類及清洗過程
h.環(huán)境溫度
2.壽命驗(yàn)證和工業(yè)生產(chǎn)可線性縮小的因素
a.柱床體積
b.層析柱直徑
c.體積流速
e.層析體積（平衡，清洗，上樣，洗脫體積）
3.需注意事項(xiàng)
a.柱效
b.柱壁效應(yīng)
c.設(shè)備放大管路及檢測器檢測范圍和靈敏度差異
4.壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證
a.色譜峰的峰形（UV,pH及電導(dǎo)）
b.產(chǎn)品收率
c.產(chǎn)品純度
d.產(chǎn)品含量（洗脫濃度及總量）
e.雜質(zhì)（種類及含量）
2.壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證
依據(jù)上面的壽命驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)， 我們利用統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行數(shù)理分析。
a.色譜峰的峰形及重疊性
b.純度：可通過SDS-PAGE及HPLC等方法驗(yàn)證

c.雜質(zhì)及含量可以通過ELISA等方法驗(yàn)證

                                                              （本文內(nèi)容來源于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系我們刪除）