導(dǎo)讀：梯度PCR儀因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同DNA片段，其適退火溫度事不同，通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增，就可以篩選出表達(dá)量高的適退火溫度，進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間。主要用于科研，教學(xué)機(jī)構(gòu)。梯度PCR儀，在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴(kuò)增。
梯度PCR儀使用注意事項(xiàng)
1、 制備測(cè)序模板：PCR儀擴(kuò)增的產(chǎn)物可以經(jīng)過(guò)低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，用于序列分析；可經(jīng)過(guò)柱層析純化，去除PCR儀反應(yīng)后剩余的dNTP和引物后，用于序列分析。PCR儀產(chǎn)物也可不經(jīng)純化直接用于測(cè)序，但是這種測(cè)序產(chǎn)生的結(jié)果較差，建議測(cè)序之前應(yīng)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化。各種標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒制備方法所純化出的質(zhì)粒均可作為測(cè)序模板使用。用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測(cè)序模板用。但要注意的是反應(yīng)體系中不應(yīng)有與引物互補(bǔ)的非目的基因序列，否則將會(huì)導(dǎo)致測(cè)序?qū)嶒?yàn)的失敗。
2、 測(cè)序引物：測(cè)序引物是指合成的與測(cè)序模板鏈特異性互補(bǔ)的寡核苷酸序列。可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對(duì)引物的5‘端進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在佳的比例，以得到高比活性的標(biāo)記引物；也可用α-32P-dATP標(biāo)記新合成的DNA鏈。引物的濃度不宜高，否則容易形成引物二聚體，或產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增引物。
3、 酶：各種缺乏3‘—5‘端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用于循環(huán)測(cè)序，其中TaqDNA聚合酶在DNA測(cè)序中為常用。雖然應(yīng)用PCR循環(huán)測(cè)序法能夠簡(jiǎn)單、快速的進(jìn)行基因序列的測(cè)定，但仍未能適應(yīng)大規(guī)模DNA序列測(cè)定的需要，而PCR循環(huán)測(cè)序法、熒光標(biāo)記和自動(dòng)測(cè)序儀的聯(lián)合使用成為大規(guī)?；蚪M測(cè)序的主要技術(shù)。該技術(shù)是采用熒光標(biāo)記引物或雙脫氧核苷三磷酸，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)特定的DNA序列分析儀和分析系統(tǒng)處理待測(cè)的DNA序列。它的應(yīng)用減輕了DNA序列測(cè)定的工作量，提高了測(cè)序的效率。
梯度PCR儀設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3’端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。