未來(lái)對(duì)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去分化的研究可以綜合運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和其他組學(xué)方法，提供關(guān)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的了解，提供更客觀的分析結(jié)果。本研究比較了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)，開(kāi)發(fā)出細(xì)胞培養(yǎng)-TFs 快速鑒定模型。該模型可以有效獲得肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng) TFs 表達(dá)譜，并對(duì)其進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)可以改善實(shí)質(zhì)細(xì)胞生存環(huán)境并延緩肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞代謝的下調(diào)。在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)上調(diào)的 TFs 和細(xì)胞增殖、免疫、死亡等過(guò)程相關(guān)，而下調(diào)的 TFs 則與代謝過(guò)程相關(guān)。未來(lái)這一模型可以為探究肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去分化機(jī)制提供更多的證據(jù)，共培養(yǎng)系統(tǒng)可以幫助我們了解各種細(xì)胞之間的相互作用。
大規(guī)模監(jiān)測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)變化有助于進(jìn)一步了解肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外去分化過(guò)程。應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞存活通路的上調(diào)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷和功能丟失過(guò)程中起重要作用，比如 MEK/ERK 和 NF-κB 途徑對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表型起負(fù)調(diào)控作用。因此在培養(yǎng)過(guò)程中的所有階段，特別是在肝細(xì)胞分離過(guò)程中，減少細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)可能是體外維持細(xì)胞活性和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表型的可行的方法。本研究中得到的一些結(jié)果可能對(duì)于單層培養(yǎng)系統(tǒng)是特異的，但使用這樣簡(jiǎn)單的系統(tǒng)可以幫助我們鑒定已知的和未知的去分化機(jī)制，了解肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去分化過(guò)程。
在小鼠灌流過(guò)程中，肝臟會(huì)出現(xiàn)缺血再灌注 (Ischemia reperfusion，I/R) 損傷，TNF-α 誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 的活化，NF-κB 通路被激活，進(jìn)而增強(qiáng) NF-κB 介導(dǎo)的 BCL-2 家族成員比如 BAK、BAX 和 BAD 的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中趨向凋亡。整體將差異顯著的 TFs 進(jìn)行功能聚類，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)可以延緩代謝的失調(diào)。我們也鑒定到另外一些和代謝、增殖相關(guān)的重要的轉(zhuǎn)錄因子，如 HNF-1α、CEBPα、 E2F3、RB1 等。
肝原代細(xì)胞體外培養(yǎng)會(huì)下調(diào)重要的LETF蛋白水平，例如HNF-1α 和 HNF-4α，其控制許多物動(dòng)力學(xué)過(guò)程和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特有的其他特征。 HNF-4α 是在肝臟里面表達(dá)很豐富的TF，參與調(diào)控脂肪酸氧化、載脂蛋白代謝、葡萄糖代謝、氨基酸代謝、血液凝結(jié)等。
對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞TFs進(jìn)行富集鑒定，發(fā)現(xiàn)0h鑒定到的TFs相對(duì)于其他時(shí)間點(diǎn)偏少，原因可能是正常的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞存在較多的高豐度蛋白 (比如白蛋白)，導(dǎo)致一些低豐度的TFs檢測(cè)不到。另外相對(duì)于0h，對(duì)其他時(shí)間點(diǎn)多出的TFs進(jìn)行功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些TFs顯著富集到MAPK、細(xì)胞周期、NF-κB 通路上。另外共培養(yǎng)在 24 h 和 48 h 鑒定到的TFs多于單獨(dú)培養(yǎng)，至于確切原因還不清楚，需要進(jìn)一步探索。
我們?cè)?TFRE 方法的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)出可以富集微量樣品中 TFs 的TOT方法。這種方法允許提取培養(yǎng)在6孔板中細(xì)胞的TFs，解決樣品量少的問(wèn)題，提高了實(shí)驗(yàn)通量。體外 TOT 富集聯(lián)合質(zhì)譜鑒定能在很短時(shí)間內(nèi)獲取TFs表達(dá)譜。從樣品制備到數(shù)據(jù)采集整個(gè)過(guò)程可以在3 h內(nèi)完成，其中包含大約1h的質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)間。由于實(shí)驗(yàn)都是在TOT和離心機(jī)中進(jìn)行，所以可以一次處理多個(gè)樣品。TOT目前可以有效獲得內(nèi)源性TFs 表達(dá)譜，相信以后隨著技術(shù)的改善，會(huì)有越來(lái)越多的TFs被鑒定到。同時(shí)我們構(gòu)建肝細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)，初步探究了非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)實(shí)質(zhì)細(xì)胞的作用，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存在可以改善實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存活和形態(tài)。
肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)大量死亡，導(dǎo)致只能獲得少量的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，TFs 在細(xì)胞內(nèi)屬于低豐度蛋白，監(jiān)測(cè) TFs 在細(xì)胞內(nèi)蛋白水平上的動(dòng)態(tài)變化變得非常困難。
3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶1(HMGCS1)ELISA試劑盒 ，英文名： HMGCS1 ELISA Kit
3-葡萄糖苷酸孕二醇(PdG)ELISA試劑盒 ，英文名： PdG ELISA Kit
28S抗核糖體抗體(28S rRNP)ELISA試劑盒 ，英文名： 28S rRNP ELISA Kit
26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基11(PSMD11)ELISA試劑盒 ，英文名： PSMD11 ELISA Kit
26S蛋白酶體(26S PSM)ELISA試劑盒 ，英文名： 26S PSM ELISA Kit
25羥基維生素D3(25(OH)D3/25 HVD3)ELISA試劑盒 ，英文名： 25(OH)D3/25 HVD3 ELISA Kit
25羥基維生素D3(25 HVD3)ELISA試劑盒 ，英文名： 25 HVD3 ELISA Kit
25羥基維生素D2(25 HVD2)ELISA試劑盒 ，英文名： 25 HVD2 ELISA Kit
20S蛋白酶體(20SP)ELISA試劑盒 ，英文名： 20SP ELISA Kit
2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)ELISA試劑盒 ，英文名： 2，3-DPG ELISA Kit
2，3－二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA試劑盒 ，英文名： 2,3-DPG ELISA Kit
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2,3Dinor血栓烷B2(2,3-dinor-TXB2)ELISA試劑盒 ，英文名： 2,3-dinor-TXB2 ELISA Kit
2 型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)(IMPDH2)ELISA試劑盒 ，英文名： IMPDH2 ELISA Kit
1型1-磷酸鞘氨醇受體(S1P1)ELISA試劑盒 ，英文名： S1P1 ELISA Kit
17酮皮質(zhì)類固醇(17-KS)ELISA試劑盒 ，英文名： 17-KS ELISA Kit
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17羥孕酮(17-OHP)ELISA試劑盒 ，英文名： 17-OHP ELISA Kit
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14-3-3蛋白(14-3-3 pro)ELISA試劑盒 ，英文名： 14-3-3 pro ELISA Kit
14-3-3 蛋白 beta/alpha(YWHAB)ELISA試劑盒 ，英文名： YWHAB ELISA Kit
12-脂氧化酶/脂加氧酶(LOX-12)ELISA試劑盒 ，英文名： LOX-12 ELISA Kit
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