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PCR引物設(shè)計(jì)遵循幾個(gè)原則

發(fā)布時(shí)間:2022-10-17瀏覽次數(shù):1045返回列表

   PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對合適的核苷酸片段,使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否, 對引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功,但遵循某些原則,則有助于引物的設(shè)計(jì)。
1.  引物的特異性
引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。
2.  避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)
某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響,選擇擴(kuò)增片段時(shí)好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明,待擴(kuò)區(qū)域自由能(△G°)小于58.6 lkJ/mol時(shí),擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí),用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。
3.  長度
寡核苷酸引物長度為15~30 bp,一般為20~27mer。引物的有效長度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因?yàn)?gt;38時(shí),適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的適溫度(74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。
4.  G+C含量
G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度,有效啟動溫度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計(jì)引物的Tm值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值好接近72℃以使復(fù)性條件佳。
5.  堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布
引物中四種堿基的分布好是隨機(jī)的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。
6.  引物自身
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷,引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。
7.  引物之間
兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性,尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
8.  引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的,不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反應(yīng)中,引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。
在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中,用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP(四種dNTP各200μmol/L)以質(zhì)粒(103拷貝)為模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下,引物3′端錯(cuò)配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20,A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100。引物A:模板G與引物G:模板A錯(cuò)配對PCR影響是等同的。
9.  引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括:加酶切位點(diǎn);標(biāo)記生物素、熒光、、Eu3+等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
10.  密碼子的簡并
如擴(kuò)增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,會影響擴(kuò)增特異性與效率。

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