一、沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物

（1）酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。

（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。

（3）變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹底。

（4）反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5－10分鐘。

（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當(dāng)而失活。

（6）使用PCR試劑盒時還應(yīng)注意：

①是否嚴(yán)格按照說明書操作；

②試劑使用前是否充分混勻；

③試劑儲存過久或不當(dāng)而失效。

二、PCR假陽性結(jié)果

（1）引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，應(yīng)調(diào)換引物。

（2）循環(huán)參數(shù)不合適，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

（3）靶序列的交叉污染。

三、溴酚藍(lán)前有區(qū)帶（很寬）

（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。

（2）循環(huán)次數(shù)太多。減少循環(huán)次數(shù)。

（3）復(fù)性度偏低。提高復(fù)性溫度。

（4）預(yù)變性后沒有立刻上機(jī)循環(huán)。

（5）引物3'端是否互補(bǔ)；重新設(shè)計(jì)合成較長的引物。

（6）引物用量偏多。降低引物的使用量。

四、擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶

（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

（2）循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。

（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

（4）退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。

（5）樣品處理不當(dāng)。

（6）Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。

（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。

五、擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀

（1）酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。

（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

（3）MgCl2濃度過高?？蛇m當(dāng)降低其用量。

（4）循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。

（5）退火溫度過低。

（6）電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒有凝固好；

③瓊脂糖質(zhì)量差。

（7）若為PCR試劑盒則可能：

①由于運(yùn)輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效；

②試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。

（8）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

六、PCR假陰性結(jié)果

（1）引物長度不夠。

（2）試劑濃度不標(biāo)準(zhǔn)。

（3）靶序列如突變、缺失等。

（4）循環(huán)參數(shù)設(shè)置錯誤。

（5）標(biāo)本中有Taq酶抑制劑。

（6）PCR產(chǎn)物檢測系統(tǒng)靈敏度不夠。