細(xì)胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)是高品質(zhì)的探針標(biāo)記及檢測(cè)產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品僅用于生物化學(xué)研究方面，本產(chǎn)品質(zhì)量好，且具價(jià)格，深為用戶稱道，了解更多細(xì)胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)等探針標(biāo)記及檢測(cè)產(chǎn)品請(qǐng)聯(lián)系我司咨詢訂購(gòu)。...

特別提示：包括細(xì)胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：細(xì)胞內(nèi)pH熒光探針(BCECF AM)
英文名稱：Intracellular pH fluorescence probe
產(chǎn)品貨號(hào)：YT357
產(chǎn)品規(guī)格：50微升

本品是zuì常用的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH的熒光探針，用于細(xì)胞內(nèi)pH檢測(cè)時(shí)，常用的BCECF AM的濃度為1-10μM。本BCECF AM(pH熒光探針)是配制于無(wú)水DMSO(anhydrous DMSO)中的儲(chǔ)存液，濃度為5mM。

BCECF AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。BCECF AM沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成BCECF，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。BCECF在適當(dāng)?shù)膒H值情況下可以被激發(fā)形成綠色熒光。zuì大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)因pH的不同而有所不同，zuì大激發(fā)波長(zhǎng)大致在503nm左右，zuì大發(fā)射波長(zhǎng)大致在520nm左右，實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm。BCECF在不同pH條件下的發(fā)射光譜參考下圖。



BCECF AM不僅被廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究，也有報(bào)道用于動(dòng)物組織、植物細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等的細(xì)胞內(nèi)pH水平檢測(cè)。在有細(xì)胞內(nèi)pH變化的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、藥物抵抗、細(xì)胞趨化等過(guò)程中BCECF AM被廣泛應(yīng)用。

注意事項(xiàng)：
1. BCECF AM(pH熒光探針, 5mM)可能對(duì)人體有害，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。
2. 本BCECF AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
3. 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期12個(gè)月。

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名稱：PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒
貨號(hào)：BTN90604A
規(guī)格：5次
PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR，zuì后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.一站式，本試劑盒提供經(jīng)過(guò)優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規(guī)PCR(用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對(duì)照反應(yīng))和5次50μl體系的標(biāo)記反應(yīng)。
3.一次標(biāo)記可以得到μg級(jí)的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標(biāo)記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和地gāo辛標(biāo)記的底物。自備的標(biāo)記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個(gè)核苷酸中有4-5個(gè)將帶有非同位素標(biāo)記)，有效降低了空間阻礙，檢測(cè)效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
2×標(biāo)記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說(shuō)明書(shū)	1份

注：標(biāo)記專用PCR Mix不含dNTP。

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準(zhǔn)備工作
1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì)PCR引物，使探針長(zhǎng)度在400-800bp之間。過(guò)短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱；過(guò)長(zhǎng)則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。
2. 根據(jù)PCR引物優(yōu)化PCR條件。
3. 由于標(biāo)記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復(fù)雜DNA為模板直接進(jìn)行PCR標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來(lái)提高成功率，即先制備非標(biāo)記PCR產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
二：非標(biāo)記PCR產(chǎn)物的制備
4. 設(shè)置50μL PCR的反應(yīng)體系：

成份	用量
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質(zhì)粒DNA
超純水	補(bǔ)到50μL

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行PCR。
6.電泳檢測(cè)和膠回收所需的PCR產(chǎn)物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產(chǎn)物(具體取決于PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記PCR。
三：標(biāo)記PCR反應(yīng)(zuì好做一個(gè)不加標(biāo)記的對(duì)照用于定量)
說(shuō)明：在設(shè)置下面反應(yīng)時(shí)，如果加一種引物，就得到單鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性，這種復(fù)性會(huì)與探針-靶DNA雜交反應(yīng)相競(jìng)爭(zhēng)，降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記的DNA探針。

成份	樣品	對(duì)照
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標(biāo)記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標(biāo)記：探針引物一和引物二 單鏈標(biāo)記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產(chǎn)物 (單鏈標(biāo)記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補(bǔ)到50μL	補(bǔ)到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標(biāo)記底物與非標(biāo)記底物的比例已經(jīng)進(jìn)過(guò)優(yōu)化，如果自備標(biāo)記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優(yōu)化，標(biāo)記不同，比例不同。對(duì)DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對(duì)BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到35-55個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的PCR產(chǎn)物，探針對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度完整性要求不高(長(zhǎng)度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好)，所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時(shí)間增加15秒，因?yàn)闃?biāo)記dUTP參入到DNA的速度比常規(guī)的dTTP慢；三是降低復(fù)性溫度5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)和對(duì)照反應(yīng)的產(chǎn)物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中額外帶有非同位素的配體(生物素，地gāo辛等)、因此其泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物(但同位素標(biāo)記不能用此法)。
 注意：如果擴(kuò)增的是單鏈DNA探針，其結(jié)合EB的能力遠(yuǎn)低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對(duì)之間的，而單鏈DNA沒(méi)有堿基對(duì)，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙鏈區(qū)，因此能結(jié)合的EB很少)，因此EB染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng)DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經(jīng)過(guò)單鏈PCR擴(kuò)增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過(guò)純化，直接加入(對(duì)單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對(duì)雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時(shí)不用請(qǐng)放-20℃長(zhǎng)期保存。如果需要純化，請(qǐng)使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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