膜流動性的測定方法主要有熒光探針標(biāo)記，電子自旋共振以及差示掃描量熱法，x 線衍射，棱碰共振等。...

線粒體膜流動性(fluidity)TMA-DPH熒光檢測試劑盒

 

產(chǎn)品編號：HR0956

產(chǎn)品組成：

保存條件：

2-8℃避光保存。長期-20℃避光。染色液避免反復(fù)凍融，需長期保存可分裝后-20℃保存。有效期1年。

【注】：

● 染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁，注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭鎳幣產(chǎn)生損耗。

線粒體膜流動性(fluidity)TMA-DPH熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明：

膜的流動性是生物膜結(jié)構(gòu)的基本特征之一，主要指膜脂肪酸鏈部分及膜蛋白的運動狀態(tài)。膜脂類分子在相變溫度以上條件下主要有側(cè)向擴散、旋轉(zhuǎn)、左右搖擺、伸縮振蕩、翻轉(zhuǎn)及異化運動等方式。膜蛋白的運動方式大體分為側(cè)向及旋轉(zhuǎn)運動，主要受脂質(zhì)雙分子層的影響。脂肪酸不飽和鍵含量和鏈的長度明顯影響著膜脂流動性，不飽和鍵的存在會降低膜脂分子間排列的有序性，從而增加膜的流動性，短鏈能減低脂肪酸鏈尾部相互作用，在相變溫度下，不易于凝集，此外，脂肪酸烴鏈圍繞C- C鍵由全反式構(gòu)型到歪扭(CAUCHE)的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)運動，也可使流動性加大。

生物膜適宜的流動性是體現(xiàn)生物膜正常功能的必要條件，在一定范圍內(nèi)，膜流動性增加，有利于膜中酶分子的擴散和旋轉(zhuǎn)運動，使酶活性增加。一些載體蛋白分子的運動性也取決于膜中脂類分子的流動性。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性主要與細(xì)胞膜P 糖蛋白過度表達(dá)谷胱甘肽及其相關(guān)酶系活性改變有關(guān)，也有許多研究表明耐藥細(xì)胞膜流動性較親代敏感細(xì)胞明顯增加。另有實驗研究發(fā)現(xiàn)腹水癌細(xì)胞的惡性程度隨著膜流動性的增加而增加，白血病及轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞的膜流動性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)移細(xì)胞。因此，對敏感及耐藥的腫瘤細(xì)胞膜流動性的監(jiān)測有著重要的意義。

膜流動性的測定方法主要有熒光探針標(biāo)記，電子自旋共振以及差示掃描量熱法，x 線衍射，棱碰共振等。

我司TMA-DPH試劑盒是利用TMA-DPH測定膜流動性的熒光探針法，它在脂蛋白及其類似系統(tǒng)的單分子層動力學(xué)研究中特別有用。DPH 及其衍生物（例如TMA-DPH）都呈圓柱形，會發(fā)生基于按長分子軸線平行排列而產(chǎn)生發(fā)射熒光向偶極躍遷。例如，它們對由于周圍脂類相互作用而導(dǎo)致的再定位非常敏感。它們廣泛地被用于旋轉(zhuǎn)運動研究中的熒光偏振分析。

TMA-DPH本身不發(fā)熒光，當(dāng)與線粒體膜結(jié)合后，熒光大大增強，TMA-DPH與可用的線粒體膜表面成比例，其熒光強度對膜表面積的增加敏感。因此，其熒光強度對于導(dǎo)致膜表面積凈變化的生理過程敏感，使其成為用于監(jiān)測諸如線粒體體積和膜變化的事件的優(yōu)異探針。TMA-DPH熒光偏振測量可與視頻顯微鏡組合，以在大脂質(zhì)體和單線粒體中提供磷脂順序的空間分辨圖像。

TMA-DPH的最大激發(fā)波長為355nm，最大發(fā)射波長為430nm。

試劑盒以外自備試劑耗材和儀器：

● 含有偏振檢測裝置的設(shè)備：熒光分光光度計/酶標(biāo)儀 ● 離心機 ● 移液器

● PBS ● 或者HBSS ● 熒光檢測專用的黑色96孔板
使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 線粒體處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

● 染色后立即進(jìn)行分析。

● 標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類而異，根據(jù)不同樣本的實際染色結(jié)果做相應(yīng)調(diào)整，在每次實驗前，請先確定最佳條件。

● 注意線粒體制備的質(zhì)量。

● 探針的信號變化直接取決于所測量細(xì)胞類型的線粒體，建議盡可能使用每孔高的線粒體密度作為起點，并根據(jù)需要減少線粒體數(shù)量。

● 可以用蛋白定量檢測線粒體數(shù)量，通常1g動物組織或5×10⁷細(xì)胞的線粒體含量為50μg以上線粒體蛋白。

● 如果需要定量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解。

● 盡可能采用高純度的線粒體樣本。

● 最好使用熒光培養(yǎng)專用的透明底黑色培養(yǎng)板。實在沒有的話可以采用透明板，注意孔間隔開，減少檢測時各孔之間的光互相干擾。

● 以下步驟僅供參考。請根據(jù)實際實驗方案實際或者參考文獻(xiàn)實驗。

線粒體膜流動性(fluidity)TMA-DPH熒光檢測試劑盒使用方法：

1、染色工作液的配制：

用稀釋液稀釋TMA-DPH 探針1000倍倍，配制成TMA-DPH染色工作液。

【注】：

● 也可以不用試劑盒中的稀釋液，直接用HBSS或PBS稀釋即可。

● 使用前做預(yù)實驗在推薦濃度范圍內(nèi)測試選定最佳濃度。

● 推薦該探針加載濃度在1000-5000倍稀釋，具體的使用濃度需根據(jù)實驗要求進(jìn)行優(yōu)化。

2、用染色工作液重懸待測線粒體樣本，在37℃孵育15-45分鐘。

【注】：

● 一般每樣為大于200mg動物組織或1×10⁷細(xì)胞的線粒體。

● 線粒體的提取操作對檢測很重要，盡量減少對線粒體的損傷。

3、用pH7.4 HBSS或20mM HEPES或PBS洗滌線粒體1次。

4、用pH7.4 HBSS或20mM HEPES或PBS重懸線粒體。

5、用該線粒體樣本進(jìn)行檢測。激發(fā)波長 355nm，發(fā)射波長430nm。

【注】：

● 熒光檢測需要使用熒光專用的透明底黑色培養(yǎng)板。

按下列公式計算熒光偏振度P：

P=（I_VV-GI_VH）/(I_VV+GI_VH)

P值越大，流動性越??；P值越小，流動性越大。

其中校正因子G=I_HV/I_HH

式中：

I_VV:起偏和檢偏器光軸同為垂直方向時測得的熒光強度(I_0°,0°)、(I_//)；

(激發(fā)光為垂直方向的偏振光，發(fā)射光為垂直方向的偏振光時測得的熒光強度)

I_VH:起偏和檢偏器光軸分別為垂直和水平方向時測得的熒光強度(I_0°,90°)、(I_⊥)；

I_HV:起偏和檢偏器光軸分別為水平和垂直方向時測得的熒光強度(I_90°,0°)；

I_HH:起偏和檢偏器光軸同為水平方向時測得的熒光強度(I_90°,90°)。

微粘度η=2P/(0.46-P)

P值越大，η越高，膜流動性越小；P值越小，η越低，膜流動性越大。

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