CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒是利用細(xì)胞熒光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，利用CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，7-AAD標(biāo)記死的靶細(xì)胞來(lái)區(qū)分不同的細(xì)胞，活的靶細(xì)胞成綠色，死的靶細(xì)胞成紅色和綠色，從而檢測(cè)細(xì)胞毒性作用。...

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR8312

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

CFSE探針-20℃避光保存，7-AAD染色液2-8℃避光保存，有效期1年。

【注】：

● 染料長(zhǎng)期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。

● 染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒是利用細(xì)胞熒光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，利用CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，7-AAD標(biāo)記死的靶細(xì)胞來(lái)區(qū)分不同的細(xì)胞，活的靶細(xì)胞成綠色，死的靶細(xì)胞成紅色和綠色，從而檢測(cè)細(xì)胞毒性作用。

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，可以用來(lái)檢測(cè)化合物的細(xì)胞毒性作用。也可以用來(lái)檢測(cè)殺傷性T 細(xì)胞或NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

CFDA-SE是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的新型染料，可以標(biāo)記活體細(xì)胞。CFDASE是一種帶有琥珀酰亞胺(NHS)的熒光染料，可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。CFDASE在結(jié)構(gòu)上將酚羥基部位改造成AM 體，所以自身不發(fā)熒光，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CFDASE的AM部位能被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成CFSE，通過(guò)共價(jià)結(jié)合賴氨酸側(cè)鏈的氨基而摻入細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的蛋白，且結(jié)合后發(fā)出強(qiáng)的綠色熒光。CFSE的琥珀酰亞胺(NHS)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基部位結(jié)合，固定在細(xì)胞內(nèi)，不會(huì)漏出細(xì)胞外。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在細(xì)胞核的熒光最強(qiáng)。

CFSE毒性小，不影響細(xì)胞的增殖能力。此方法操作簡(jiǎn)單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患?？梢愿焖伲鼫?zhǔn)確和更安全地得到想要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

CFSE/7-AAD標(biāo)記細(xì)胞后通常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。

一般試劑盒采用PI與CFSE 聯(lián)用，但是由于PI的發(fā)射波長(zhǎng)是<625nm,通常在FL2中檢測(cè),對(duì)CFSE 的干擾大。而且由于波譜較寬，同時(shí)在FL3中也能測(cè)，所以用了PI 最多再加一個(gè)CFSE，F(xiàn)L3就沒(méi)法用了。PI還有一個(gè)重要的缺點(diǎn)是不容易清洗干凈,使用后清洗流式細(xì)胞儀更加費(fèi)時(shí)費(fèi)物。

7-AAD/CFSE試劑盒有效的解決了這些弊端，7-AAD的發(fā)射波長(zhǎng)是650nm,只占用FL3通道進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)ITC、PE 兩個(gè)通道受影響都小，可以做三色分析。

CFSE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，熒光波長(zhǎng)：λex=496 nm,λem=516 nm。流式檢測(cè)時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)可以選擇488nm，此時(shí)的發(fā)射波長(zhǎng)為516nm，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)可以采用FL1 detection channel。7-AAD 標(biāo)記細(xì)胞呈紅色熒光，流式檢測(cè)時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)可以選擇488nm，此時(shí)的發(fā)射波長(zhǎng)為650nm，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)可以采用FL3 detection channel。

CFSE標(biāo)記的細(xì)胞除了流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞毒性外，還可單染后用于細(xì)胞增殖檢測(cè)，或者用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。

檢測(cè)方法：

● 熒光顯微鏡 ● 流式細(xì)胞儀 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器:

● 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ● 離心機(jī) ● CO₂培養(yǎng)箱 ● PBS或者HBSS（不含酚紅） ● 熒光專用黑色96孔板

使用注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 染色濃度根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異。

● CFSE母液極易水解，建議分裝保存，分裝后用封口膜密封管口，再用錫箔紙包裹，最后和干燥劑一起用塑料袋密封，≦-20℃冷凍保存。

● 冬天氣溫較低時(shí)CFSE溶解液會(huì)凝固，可先在37℃水浴至溶解液完全融解后再進(jìn)行配制，配制過(guò)程中注意避免溶液凝固，保持溫度至CFSE溶解完全。

● CFSE工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不能提前配制，因?yàn)镃FSE吸水會(huì)分解，影響染色效果。

● CFSE易被水解，在水溶液中會(huì)很快變質(zhì)。母液請(qǐng)?jiān)谑褂眠^(guò)程中避免接觸水。工作液在標(biāo)記細(xì)胞的過(guò)程中和水接觸是在許可的時(shí)間范圍內(nèi)的。

● CFSE標(biāo)記細(xì)胞僅需5-15分鐘即可完成。對(duì)于不同細(xì)胞，最佳標(biāo)記時(shí)間需自行摸索。正式實(shí)驗(yàn)前，建議先做幾個(gè)孔摸索染色濃度和加入CFSE試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

● 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

● 以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)或參考相關(guān)文獻(xiàn)為準(zhǔn)。

● 必須設(shè)置全陰，CFSE單標(biāo)，7-AAD單標(biāo)的靶細(xì)胞的參照以設(shè)置流式。

使用方法：

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒細(xì)胞CFSE染色：

1.根據(jù)需要檢測(cè)的細(xì)胞樣品數(shù)，用HBSS將CFSE母液200～4000倍稀釋，配制成CFSE染色工作液。不同的細(xì)胞需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳染色濃度。如果熒光強(qiáng)度弱，可以適當(dāng)提高CFSE的終濃度。如果背景太高，可以適當(dāng)降低CFSE的終濃度，請(qǐng)摸索條件找到最佳濃度。

【注】：

● 也可以用HBSS等緩沖液或相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋染料母液至所需濃度。

● 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用HBSS緩沖液或培養(yǎng)基稀釋CFSE到需要的工作濃度。工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度，一般染色終濃度200～4000倍稀釋。

● 一般起始濃度按500～1000倍稀釋即可。

● 為了降低過(guò)度加載染料導(dǎo)致的潛在背景和細(xì)胞毒性，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.將培養(yǎng)好的待測(cè)靶細(xì)胞消化后收集，用PBS洗滌2次。

【注】：

● 400×g離心5分鐘。

3.將待測(cè)細(xì)胞用染色工作液重懸，至細(xì)胞濃度大約10⁷/ml。

4.在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育15～30分鐘。

5.加10倍體積的含血清培養(yǎng)基，400×g離心5分鐘。

6.離心后去上清，收集細(xì)胞，用HBSS或無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1～2次，最后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

7.在37℃培養(yǎng)箱中孵育20～30分鐘。

細(xì)胞模型制備：

1.收集待檢測(cè)的靶細(xì)胞。

2.進(jìn)行相應(yīng)的毒性藥物處理或者效應(yīng)細(xì)胞處理。

【注】：

● 效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例根據(jù)需要自行設(shè)定。常見(jiàn)比例如6.25：1；12.5：1；25：1等。

● 活的靶細(xì)胞成綠色；死的靶細(xì)胞成紅色和綠色；死的效應(yīng)細(xì)胞成紅色，活的效應(yīng)細(xì)胞成無(wú)色。

細(xì)胞檢測(cè)：

1.收集制備好的毒性處理過(guò)的細(xì)胞模型。

2.用200μL HBSS重懸細(xì)胞，加入1μL 7-AAD染色液，混勻。

【注】：

● 微量的染色液注意有效的加入細(xì)胞懸液并充分混勻。

● 可以根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的染色液濃度，直接用7-AAD和HBSS緩沖液配制成染色工作液，并用染色工作液重懸細(xì)胞。

3.在2～8℃避光孵育10～60分鐘。

4.在400×g離心5分鐘收集細(xì)胞。

5.用500μL HBSS或PBS重懸細(xì)胞。

6.取500μL細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)。

7.根據(jù)流式結(jié)果計(jì)算死亡細(xì)胞百分率。被殺傷死亡的靶細(xì)胞被7-AAD染上會(huì)出現(xiàn)在CFSE+7-AAD+區(qū)域，未殺傷的在CFSE+7-AAD-區(qū)域，得出被殺傷的靶細(xì)胞的比例。用這個(gè)比例再計(jì)算毒性。

如果您覺(jué)得“HR8312 CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒”描述資料不夠齊全，請(qǐng)聯(lián)系我們獲取詳細(xì)資料。(聯(lián)系時(shí)請(qǐng)告訴我從給覽網(wǎng)看到的，我們將給您最大優(yōu)惠！)
本頁(yè)鏈接：http://18bearing.com/com_bjbiolab/sell/itemid-9459008.html
已經(jīng)有1001位訪客查看了本頁(yè).