本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。本試劑盒提取的蛋白含高濃度鹽成分，不可直接用于2D電泳，如下游實(shí)驗(yàn)需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請使用其他貨號試劑盒。也可將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，可用蛋白脫鹽柱脫鹽處理(HR0389)。...

細(xì)胞核膜蛋白提取試劑盒

 

產(chǎn)品編號：HR0149

細(xì)胞核膜蛋白提取試劑盒試劑盒組成：

儲存條件：

提取液、溶解液2～8℃保存，蛋白酶抑制劑-20℃保存。有效期1年。

【注】：

● 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃保存，開蓋使用后-20℃保存。

● 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態(tài),從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時間水浴,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

產(chǎn)品簡介：

核膜蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種原代或傳代細(xì)胞和各種實(shí)體組織(如腦、脊髓、神經(jīng)結(jié)或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結(jié)締組織等動物組織)中提取細(xì)胞核的膜蛋白。

本試劑盒含有的獨(dú)特配方能有效溶解細(xì)胞核膜組份，本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物能有效阻止蛋白酶對蛋白的降解，以保障提取高純度的蛋白。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然構(gòu)象的活性蛋白，可用于Western Blotting、蛋白電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、、酶活性測定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒提取的蛋白含高濃度鹽成分，不可直接用于2D電泳，如下游實(shí)驗(yàn)需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請使用其他貨號試劑盒。也可將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，可用蛋白脫鹽柱脫鹽處理(HR0389)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便，從細(xì)胞中提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

● 將蛋白提取的時間縮短至1小時。

● 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

● 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器 ● 離心機(jī) ● 振蕩器 ● 勻漿機(jī)/勻漿器 ● 渦旋混勻器 ● PBS

● 蛋白定量試劑盒

細(xì)胞核膜蛋白提取試劑盒注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)中的所有試劑須預(yù)冷，所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷，整個過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

● 提取液B在使用前需一直置于2-8℃，否則下游膜蛋白提取時會導(dǎo)致不容易分層。

● 膜蛋白電泳時Loading Buffer應(yīng)該避免煮沸。

● 膜蛋白電泳時可以提高Loading Buffer的SDS含量。

使用方法：

1、提取準(zhǔn)備：

每500μL冷的提取液A和B中分別加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需處理的樣品量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未用完，再次用前需重新加入蛋白酶抑制劑。

2、取5～10×10⁶個細(xì)胞，在4℃，500×g條件離心2～3分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。

【注】：

● 由于核膜蛋白含量較少，需要較多的細(xì)胞才能保證得率，因此在條件允許的條件下，盡可能加大細(xì)胞量。

3、用冷PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4、細(xì)胞沉淀中加入400μL冷的提取液A，高速渦旋振蕩15秒，置2-8℃條件振蕩15～30分鐘。

【注】：

● 提取液A處理后細(xì)胞體積應(yīng)減小，否則延長提取液A振蕩處理時間。

● 使用振蕩器或搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取液可輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可不振蕩，稍微延長提取液處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

5、在4℃，10000×g條件下離心5分鐘。棄上清，留沉淀。

6、在沉淀中加入300～500μL冷的提取液B，高速渦旋振蕩15秒，充分混勻。

【注】：

● 每次的裂解液用量并不是一定的，請根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

● 由于核膜蛋白含量較少，需要較多的細(xì)胞才能保證得率，因此在條件允許的條件下，盡可能加大細(xì)胞量。

● 提取液B在使用前需一直置于2-8℃，否則下游膜蛋白提取時會導(dǎo)致不容易分層。

7、置2～8℃條件下振蕩20～30分鐘。

【注】：

● 此步驟必須在2～8條件下振蕩。

● 使用振蕩器或搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持提取液可輕微晃動即可。

● 無振蕩條件也可不振蕩，置2～8℃靜置，稍微延長提取液處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。

8、在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。

9、將上清吸入另一干凈的離心管，在37℃水浴10分鐘。

10、在37℃，1000×g離心5分鐘。此時溶液分為兩層，下層是核膜蛋白約為30～50μL。

【注】：

● 此步驟必須在37℃條件下離心。

● 沒有37℃離心條件的也可以不離心，稍微延長37℃水浴時間，至液體澄清，分層清晰。

11、此時溶液分為兩層，小心吸掉上層，留著備用分析，分離出管底部下層大約30～50μL液體。

【注】：

● 下層為核膜蛋白。

● 下層為粘稠狀液體。

● 待下游目的核膜蛋白試驗(yàn)完成后再丟棄上層部分。核膜蛋白萃取不完全時此上次部分蛋白仍可以進(jìn)行再次提取核膜蛋白。

12、用50～200μL冷的溶解液C稀釋該下層核膜蛋白部分，即得細(xì)胞核膜蛋白樣品。

【注】：

● 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次，靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

● 靜置直至管底透明膠狀物完全溶解。

13、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題，注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

常見問題分析：

● 蛋白濃度低？

膜蛋白豐度比較低,在條件允許的情況下,需要盡可能加大細(xì)胞的上樣量以提高膜蛋白濃度。

處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全,導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長試劑A的處理時間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理,沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法,因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份,導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系,則可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份,不破壞蛋白的結(jié)構(gòu),沒有對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞,蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

● 膜蛋白電泳沒有條帶？

膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進(jìn)行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可超聲處理一下，再進(jìn)行蛋白定量。

蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。

蛋白Loading Buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。

有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。

電泳時最好采用低電壓低電流電
泳。

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