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所在地:北京
型號:HR8599
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更新時間:2023-08-28
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公司地址:北京市海淀區(qū)紫雀路33號院3號樓
TRITC-Phalloidin染色試劑盒
產(chǎn)品編號:HR8599
產(chǎn)品組成:
組份 |
100T |
250T |
組份A:TRITC-Phalloidin染液 |
100μL |
250μL |
組份B:染料稀釋液 |
10mL |
20mL |
TRITC-Phalloidin染色試劑盒儲存條件:
染料-20℃避光保存;稀釋液2-8℃保存。有效期6個月。
【注】:
● 染料短期2 周內(nèi)可以2-8℃保存。染料長期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。
● 染色液A 為DMSO 溶液,冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱,否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。
產(chǎn)品簡介:
細(xì)胞骨架染色試劑盒采用絲狀肌動蛋白F-actin熒光染色法染色細(xì)胞骨架,可以用于各種動物、植物的細(xì)胞骨架染色。本試劑盒采用熒光探針TRITC(Rhodamine,羅丹明,Tetramethylrhodamine Isothiocyanate)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)來標(biāo)記骨架蛋白F-actin。TRITC為橙紅色熒光探針。
細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是真核細(xì)胞中由蛋白質(zhì)聚合而成的三維纖維狀網(wǎng)架體系。細(xì)胞骨架包括微絲、微管和中間纖維。細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài),承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用。細(xì)胞骨架肌動蛋白是球形的、大約42kd蛋白,在幾乎所有的真核細(xì)胞都存在。這是一個非常保守的蛋白,在各物種差異不超過20%。肌動蛋白是兩種細(xì)胞內(nèi)絲狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)成單體:微絲(三種主要的細(xì)胞骨架成分之一),以及細(xì)肌絲(是肌肉細(xì)胞收縮復(fù)合物的一部分)。肌動蛋白參與很多重要的細(xì)胞功能,包括肌肉收縮,細(xì)胞移動,細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂、小泡和細(xì)胞器的運(yùn)動、細(xì)胞信號,以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形態(tài)的保持和建立。
顯示細(xì)胞骨架的常用方法有兩種:骨架蛋白染色法和免疫熒光染色法。骨架蛋白染色法具有簡單易行的特點(diǎn),但不能區(qū)分骨架蛋白的組成,有些類型的纖維太細(xì),在光學(xué)顯微鏡下無法分辨,常用于骨架形態(tài)及完整性研究;免疫熒光染色法可特異顯示骨架蛋白,是用一種微絲解聚抑制劑,它與肌動蛋白纖絲有強(qiáng)親和作用,使肌動蛋白纖絲穩(wěn)定,抑制解聚,且只與F-actin結(jié)合.因此,利用熒光標(biāo)記可以清晰顯示細(xì)胞中微絲的形態(tài),利用熒光顯微鏡對熒光標(biāo)記的細(xì)胞骨架進(jìn)行觀察,可以得到清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.具有更普遍的應(yīng)用意義。
TRITC-Phalloidin染色反應(yīng)特異性強(qiáng),對比性高,具有比Actin抗體更好的染色效果,適合用作F-actin的定性和定量檢測。另外,經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性,適用性廣泛。TRITC-Phalloidin可以廣泛用于固定、通透性細(xì)胞,但也可以進(jìn)入活細(xì)胞中。
TRITC-Phalloidin染色試劑盒試劑盒以外自備試劑和儀器:
● 熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● PBS緩沖液 ● 固定液4%多聚甲醛 ● 透化液0.05-0.1% Triton X-100(溶于PBS) ● 100 nM DAPI溶液 ● 蓋玻片周圍密封液(如透明指甲油) ● 純水 ● 載玻片和蓋玻片
使用注意事項(xiàng):
● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體損失。
● 標(biāo)本應(yīng)新鮮,且未受其他化學(xué)物品污染。
● 應(yīng)根據(jù)組織、細(xì)胞類型不同調(diào)整通透時間。
● 動物細(xì)胞樣本細(xì)胞通透劑處理的時間很關(guān)鍵,如果處理時間太短,會造成很深的背景顏色,干擾細(xì)胞骨架的觀察;如果處理時間太長,會破壞骨架蛋白使骨架纖維斷裂,造成細(xì)胞空洞。通透時間應(yīng)控制在10-35分鐘。需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的染色結(jié)果確定最佳通透時間。一般預(yù)實(shí)驗(yàn)起始通透時間植物樣本為10分鐘,動物細(xì)胞樣本5分鐘。
● 染色液染色時間根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行調(diào)整,顏色過淺可延長染色時間,顏色過深可縮短染色時間。
● 洗片時動作要輕柔,避免將細(xì)胞從玻片上洗掉。
● 染色后用水充分洗滌,自然晾干即可,不能用常規(guī)的酒精梯度脫水方法。
● 不同樣本的操作方法稍有差異,請根據(jù)具體樣本操作。
● 下面以細(xì)胞爬片/涂片樣本的染色為例,滴加相應(yīng)的試劑到玻片上,加樣量以覆蓋樣本即可。如果是植物切片等,也可以在離心管、試管等里面進(jìn)行洗滌、通透、染色等操作,最后置載玻片上觀察即可。
使用方法:
1. 染色工作液配制:
根據(jù)樣本數(shù)量,用染料稀釋液將TRITC-Phalloidin熒光染料10倍稀釋。
再用相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基或其他緩沖液(如HBSS、PBS等)將熒光染料進(jìn)行10倍稀釋,配制成染色工作液。
【注】:
● 也可以不使用本試劑盒中的試劑B,直接用相應(yīng)的培養(yǎng)基或HBSS等緩沖液稀釋染料至所需濃度。
● 開始實(shí)驗(yàn)前,使用培養(yǎng)基或HBSS緩沖液稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度,建議至少在超過10 倍范圍的濃度下進(jìn)行測試。一般染色終濃度50-150 倍稀釋,100倍適合大多數(shù)細(xì)胞樣本。
● 工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳工作濃度。起始測試工作濃度可以用100倍稀釋。
● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
● 建議收到產(chǎn)品后,根據(jù)單次使用量,對母液進(jìn)行小量分裝,-20℃避光凍存,一年穩(wěn)定。
2. 將制作好的細(xì)胞爬片/細(xì)胞涂片用37℃預(yù)熱的1×PBS(pH 7.4)清洗2次。
3. 細(xì)胞固定:滴加溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定,室溫固定5-10分鐘,立即用PBS洗滌3-5次。
【注】:
● 避免固定劑中含有甲醇成分,因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^程中可能破壞肌動蛋白。
● 樣本多時可用容器裝好PBS分別浸泡洗滌3-5次,樣本較少時也可以加500μL PBS到玻片上進(jìn)行洗滌。
● 此步驟為動物細(xì)胞樣本的步驟,植物切片類不需要做此步驟,第2步洗滌完直接進(jìn)行第4步通透即可。
4. 室溫條件下,透化細(xì)胞:滴加0.05-0.1% Triton X-100/PBS溶液透化處理樣本,處理3-5分鐘。
【注】:
● 經(jīng)Triton破膜過度后,TRITC-Phalloidin可能對細(xì)胞核有非特異性染色,注意通透時間。
● 該步驟可以省略,因?yàn)門RITC-Phalloidin分子量比較小,多聚甲醛固定后細(xì)胞膜產(chǎn)生的部分孔洞可以讓TRITC-Phalloidin進(jìn)入細(xì)胞。
5. 室溫條件下,用PBS洗細(xì)胞3-5次,自然晾干。
6. 室溫條件下,染色:用適量細(xì)胞骨架染色液工作液,覆蓋住玻片上的細(xì)胞,室溫避光孵育40分鐘-更長時間,最長可以過夜染色,一般40分鐘-1小時即可。
【注】:
● 可以在染色工作液內(nèi)加入終濃度為1% BSA,能起到降低背景的作用;
● 或者在染色前用含1% BSA的PBS液室溫封閉細(xì)胞20-30分鐘。
● 孵育過程中為了避免溶液揮發(fā),可將玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。
7. 用PBS洗細(xì)胞3次,每次5分鐘。自然晾干。
8. 使用適量濃度為100nM的DAPI溶液對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染,約30 秒即可。
【注】:
● 此步驟為選做步驟,可以不進(jìn)行核復(fù)染。
● 也可以根據(jù)需要選擇其它顏色的核染料。
9. 用PBS洗細(xì)胞。
10. 用激光共聚焦顯微鏡觀察。TRITC-Phalloidin激發(fā)/發(fā)射波長540-545/565-595nm和DAPI激發(fā)/發(fā)射波長359-364/454-461nm。
【注】:
● 或封片后觀察。
● 標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存,通常6個月內(nèi)可繼續(xù)做染色分析。
染色結(jié)果:
細(xì)胞骨架纖維呈橙紅色。細(xì)胞核呈藍(lán)色(如果DAPI復(fù)染)。
細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表面分布許多排列不規(guī)則的纖維束,走向清晰。
【注】:
● 如果見到部分細(xì)胞骨架纖維并非呈纖維狀,而是呈串珠狀或顆粒狀,可以進(jìn)一步優(yōu)化通透、染色時間、染液濃度等條件。
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